小鼠肝组织白蛋白基因.docVIP

小鼠肝组织白蛋白基因、葡萄糖醛酸基转移酶基因RT-PCR检测 （管冬元 梁超） 一．材料与试剂 DEPC 处理水 用DEPC 处理水配制的75%乙醇（分析纯） 氯仿 异丙醇 Tizol （Gibco BRC公司） M-MuLV（200U/ul） Taq polymerase（5U/ul） RNAsin （40U/ul） DNTP（each 10mM ） marker （each 100bp, 100-1000bp） EB2mg/ml ） 5×TBE 琼脂糖 小鼠白蛋白基因的上、下游引物 随机引物50uM 兰、黄枪头（进口） 0.5ml 1.5ml 离心管 （进口） 冷冻台式离心机 电动匀浆器及匀浆管 20，200，1000ul移液器 剪、摄等手术器械，筒纸，电子天平，量筒 真空干燥器 -20℃及-70℃冰箱 752分光光度计及石英比色皿 PCR仪 电泳仪，照像机，胶卷 肝组织 实验过程 （一）RNA抽提 １．取肝组织50mg，剪碎，加入1ml Trizol液，快速电动匀浆。 ２．22℃， 静置5min ３．加入氯仿0.2ml，颠倒15s ４．22℃，静置3min ５．离心：4℃，15000转/分×15min ６．取上清液0.5ml ７．加入0.5ml异丙醇，混匀 ８．22℃，静置10min ９．离心：4℃，15000转/分×10min １０．弃上液 １１．加入1ml 4℃ 75%乙醇 １２．离心：4℃，10000转/分×5min １３．弃上液，真空干燥5min １４．用25ul水溶解，-70℃保存。 （二）反转录（ＲＴ） 5*buffer 4ul dNTP 10mM 2ul 随机引物 100ug/ul 1ul DTT 100mM 1ul RNAsin 40U/ul 1ul 总RNA 2ug 2ul 水 至18ul 15号程序： 65℃，5分钟；冰上，加RNAsin 1ul，M-MLV 1ulPCR反应体系： dNTP（each 0.5mM） 2ul 10×buffer 4ul MgCl2 （25mM） 4ul 上、下游引物（4uM）各 1ul RT产物 4ul Taq酶 0.4ul 加水至 40ul PCR反应条件 运行33号程序 为：94℃ 3min →94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环→72℃ 5min→4℃ 保存 （四）电泳 1．制作电泳凝胶模具 ２．电泳缓冲液：1×TBE 250ml ３．作1.4﹪琼脂糖凝胶（60ml） 双蒸水 48 ml 5×TBE 12ul 琼脂糖 0.84g 煮沸，冷却至60℃左右，加： EB 3.5ul 混匀，灌胶 ４．制备样品，取20ul PCR样品，加4ul加样缓冲液，混匀，依次上样：DNA marker 6ul，正常组 24ul，模型组 24ul，治疗对照组 24ul ５．电泳：80V，0.5-1小时 ６．紫外灯下观察目标基因片段，并拍照。 附参考文献： 1、《分子克隆》第二版 2、李永明, 赵玉琪. 实用分子生物学方法手册. 第一版. 北京: 科学技术出版社, 1998, 274~291 2