蛋白质一级结构测定解释.pptVIP

蛋白质一级结构测定;蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中氨基酸的组成、排列顺序连接方式和二硫键的位置。;蛋白质一级结构测定的程序; 在进行蛋白质序列测定时，第一步工作就是提纯蛋白，用于测序的蛋白样品中不能含有杂蛋白，一般纯度要求达到97%以上或能形成结晶。样品的纯度需用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。; 天然蛋白质分子量的测定，对于蛋白质一级结构的测定是十分重要的信息。根据蛋白质的分子量和蛋白质分子中氨基酸的平均分子量，可以大致估计蛋白质分子中氨基酸组成的数目。 ; 对蛋白质分子量测定以后，经过亚单位的拆分，比较分子量有无变化。如无变化，说明蛋白质是由一条肽链所构成；若发生了变化，说明蛋白质是由多条肽链所构成。假如是由多条肽链构成的，还要知道是相同的肽链还是不同的肽链所组成以及待分析的蛋白质由几条肽链所组成，这个工作可以用聚丙烯酰胺电泳进行测定。; 大多数蛋白质分子中都含有半胱氨酸，两个半胱氨酸之间可以形成二硫键，如蛋白质分子中含有多个二硫键时，必须正确判断二硫键的位置，天然蛋白质中只有一种正确的二硫键的形成方式，如果二硫键的位置发生错配，将失去蛋白质的生物学活性。如有多条二硫键时，存在有多种形成方式，如牛胰核糖核酸酶有四条二硫键，存在108种可能的配对方式，但只有一种方式是有生物学活性。因此，在测序时，必须明确测出二硫键的正确位置。;氨基酸与肽的定量组成测定;2、碱水解法：蛋白质与碱共热而发生水解。;3、酶水解法：是最温和的水解方法。;氨基酸的衍生分离及检测;氨基酸组成测定;Date;氨基酸自动分析仪原理图;多肽链的末端分析; 2,4-二硝基氟苯法： 英国的科学家F.Sanger 于1945年提出，是一个理想的氨基端测定试剂。2,4-二硝基氟苯在很温和的条件下（室温，pH8），就能与氨基酸的氨基、多肽或蛋白质的氨基末端进行反应，生成黄色的二硝基氟苯衍生物（DNP蛋白等）。 ;DNP蛋白在6M盐酸，105℃，16小时进行完全水解，只有N末端的氨基酸与2,4-二硝基氟苯反应生成二硝基氟苯氨基酸。用乙醚提出后与同样处理的标准氨基酸一起进行滤纸或薄层层析，对照鉴定末端氨基酸确定待测蛋白的氨基末端。; 氨 基 端 的 分 析;Date; 丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley等1956年报告了丹磺酰氯与氨基酸、肽或蛋白质的氨基反应产生黄色的荧光，由此产生了测定N末端的新方法，称DNS法。 本法测定N末端的原理与DNP法有相似之处。但比DNP法的灵敏度提高了100倍，使用更为广泛。 ; 本法的优点： （1）在相当温和的条件下就能与蛋白质的肽链的N端氨基反应且反应产物很耐酸水解； （2） DNS氨基酸在紫外光激发下产生黄色荧光，可以进行荧光测定； （3 ） DNS氨基酸很适于电泳和层析分离，分辨率和准确度都很高，操作比较简单。;;丹磺酰氯（DNS-Cl）法双向层析指纹图;异硫氰酸苯酯法：目前应用最广泛的一种氨基末端的测定方法多肽或蛋白质与PITC在pH≈9，40 ℃作用时形成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（简称PTC多肽或蛋白质）后者与酸在有机溶剂中反应后，代表N末端的PTC氨基酸环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物而从肽链上掉下来，此产物可用气液色谱法进行鉴定。;本法的优点：;Date;Date;硼氢化锂法： 肽链的C末端氨基酸可用硼氢化锂还原使成相应的α氨基醇。肽链水解后，代表C末端氨基酸的α氨基醇，可用层析法加经鉴定。;肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用滤纸层析法鉴定。;羧肽酶法：羧肽酶法是C端氨基酸测定的主要方法。羧肽酶A水解蛋白质或多肽时，是从C端氨基酸开始的。每一次裂解下一个C端氨基酸残基。切下第一个氨基酸以后，还可以继续切下第二个、第三个氨基酸; 羧肽酶A对蛋白质的水解作用图;（一）色氨酸的测定：色氨酸是组成蛋白质的重要氨基酸之一，在一些蛋白质的氨基酸组成的分析数据中经常缺少这个氨基酸的数据，这是由于酸水解时色氨酸几乎全部被破坏，可用碱水解法或酶水解法加以弥补，然后再进行测定。常用的方法有以下两种： （1）对-二甲基氨基苯甲醛法：含有色氨酸的碱水解液加入对-二甲基氨基苯甲醛的浓硫酸溶液和亚硝酸钠溶液，强酸条件下反应生成蓝色化合物，590nm测定光吸收值，此法现已被广泛应用。;（2）三价铁显色法： 含有色氨酸的样品，与铁离子的醋酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈玫瑰红色，在545nm比色测定。 此法测定简便、快速，线性关系较好。