03细胞生物学研究方法黄宜兵吉大重点.pptVIP

黄宜兵 ;内容提要;从整个生命科学的发展趋势看细胞 生物学方法;;一、光学显微镜技术（light microscope）;（1）普通光学显微镜;3. 分辨率resolution：指区分开两个质点间的最小距离。 光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．A． λ为入射光线波长； N=介质折射率； N．A．为镜口率 ＝N*sin(α/2)； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。;4.光学显微镜的几个特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin α /2的最大值小于1；镜口率最大约1.6； 普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。;小鼠肝细胞中糖原;（2）相差显微镜;光路;用途：观察未经染色的玻片标本。;（3）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）;分离的有丝分裂纺锤体 左、微分干涉显微镜；中、相差显微镜； 右、偏振光显微镜。;（4）荧光显微镜 Fluorescence microscope;与普通光学显微镜相比，荧光显微镜的光源和光学系统不同，其核心部件为滤光片系统和专用的物镜镜头： A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。 B.滤片：根据性能分为两组。 一是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。 二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。 ; 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 常用荧光染料：FITC, DAPI，GFP,罗丹明B等;（5）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM;;LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue);二、电子显微镜;1. 原理;不同光线的波长;电镜与光镜的主要区别;2. 主要电镜制样技术;2）负染技术;A.冰冻标本（-1000C干冰或-1960C液氮） B.冷刀断开标本（冰冻断裂） C.升温，冰升华，断裂面结构暴露（蚀刻） D.表面喷一层重金属铂和一层碳 E.将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜（replica） F.电镜下观察复膜，复膜构造=标本构造;4）. 电镜三维重构与低温电镜技术 研究生物大分子的三维结构 发明电镜三维重构技术的英国克卢格（A.Klug） 于1982年获得诺贝尔化学奖，适于研究难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白-核酸复合物形成的三维结构 低温电镜技术不需要固定、染色和干燥 电镜三维重构技术与X射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术，是研究生物大分子空间结构及相互作用关系的主要实验手段。;TEM LIGHT PATHWAY;观察标本内部细微结构;4. 扫描电子显微镜;Scanning electron microscope（ SEM）;人类红细胞;5. 扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM;扫描隧道显微镜原理;6. 原子力显微镜 atomic force microscope AFM;;一、离心技术;（一）差速离心 Differential centrifugation;（二）密度梯度离心;1. 速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation;二、细胞组分的化学显示方法 利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅判断某种物质在细胞中的分布及相对含量。细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。;常见的化学显色方法;三、免疫细胞化学（immunocytochemistry) 根据免疫学原理，利用抗体同特异性抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。 抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特异的抗原分泌的r球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 体内：免疫荧光与免疫电镜 体外：免疫印迹western blottin