3-2细胞生物学研究方法重点.ppt

第二节 细胞组分的分析方法;一、离心分离技术;?基本原理: 当悬浮液静止不动时，由于重力场的作用，较大的悬浮颗粒会逐渐沉降，颗粒越重下沉越快，反之会上浮。但很小的颗粒不仅沉降速度慢，而且扩散现象严重，很难或根本无法沉降。这样就需离心的方法产生出离心力场，使之产生沉降。 ?一般步骤： 匀浆化：破坏细胞，使细胞崩解。方法有：低渗、超声波粉碎、强制过滤、研磨等； 离心处理； 收集分析。 ;沉降系数（Sedimentation Coefficient） 颗粒在离心场中的沉降速度的大小与颗粒大小、形状、密度、离心力、悬浮介质的密度和粘度有关。单位离心力场中溶质分子的沉降速度称为沉降系数通过下式计算： S=dx /dt/ω2x x：颗粒到转头中心距离（cm）；. ω：角速度（弧度/秒）；dx/dt：沉降速度；S：沉降系数（单位：秒）。 各种颗粒都有一定的沉降系数，习惯上（规定）把10-13秒作为一个沉降系数单位，简写成S（Svedberg unit，斯维得伯格单位，瑞典人，1926年设计超速离心机，因此获诺贝尔奖。） 如某一蛋白质的沉降系数为5S，说明它的沉降系数实际上是5×10-13秒，S值越大，说明颗粒的沉降速度越大。; 离心机转数（转/分，用rpm或r/min表示）与重力加速度（g）是什么关系呢？; 离心方法的选择 根据分离对象和目的不同，采用不同的离心方法。 制备离心 (preparative centrifuge) 分离和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品。 差速离心法：是最常用的方法，根据不同离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。 此方法可有效的分离大小上差别较大的颗粒，但不能分离大小相似的颗粒，而且分离出来的组分往往不纯，混有其他性质的颗粒。 ;;差速离心（P64图3-18）; 分析离心（analytical centrifuge） 分析和测定制剂中纯的大分子的种类和性质，如浮力密度和分子量、生物大分子的构象变化、分析样品的纯度等。此工作必须是在制备离心的基础上进行。密度梯度离心法是最常用的方法。 密度梯度离心法又称为区带离心法，用于沉降系数较接近的物质的分离，可以同时使样品中几个或全部组分分离。不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成不同的沉降带的方法。单一的酶都可分离。 常用介质有蔗糖、氯化铯。 分为： 速度沉降：密度相近而大小不一组分。（梯度浓度） 等密度沉降：不同密度组分。连续密度高浓度介质离心力场长时间作用。十分灵敏，可分辨到同位素级别。（连续梯度） 　　;密度梯度离心; 二、 细胞成分显示方法;一）化学显示剂法 基本原理： 利用某些化学物质和某些细胞成分发生化学结合，从而显示出一定的颜色，进行定性和定位研究的方法。 1、Feulgen reaction 酸水解去除RNA，并除去嘌呤，醛基与希夫（schiff）试剂作用形成紫红色。 ; 2、Brachet reaction 甲基绿——派罗宁染色显示RNA 3、P.A.S reaction 过碘酸氧化作用破坏多糖的1，2—乙二醇基，使醛基暴露，与Schiff试剂作用显示紫红色。 4、四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，由此证明脂肪滴的存在。 5、碱性磷酸酶的格莫瑞法（Gomori） 碱性磷酸酶 Ca2+ 转变 甘油的磷酸脂 → 释放P043- → Ca3（P04）2 → 金属银、硫化铅等有色化合物。 ;三、特异蛋白抗原的定位与定性; 基本原理：将免疫学中抗原、抗体以及补体间专一性反应结合显微或亚显微组织学的一些研究方法的统称。是免疫学原理与光镜或电镜技术的结合。 一般说来，发生在组织细胞内的抗原抗体反应是不可见的，但如果事先将某种荧光素、酶、同位素、铁蛋白等用生化方法标记在抗体分子上（标记抗体），或用血清学方法将酶与其抗体形成可溶性物质，就能凭借特殊光镜及电镜等观察标本中的荧光现象、酶作用的沉淀物（颜色）、放射线径迹及高电子密度物质的有无和部位，由此判断是否发生了特异性的抗原抗体反应以及抗原物质的定位分布。;因此利用此技术可以： 1）对细胞表面或细胞内部的抗原进行定位；2）了解抗体合成过程中的动