生物制药第十三章重点.pptx

动物基因工程药物一、动物细胞培养二、动物转基因技术三、动物反应器与动物基因（一）动物细胞培养定义：是模拟体内生理环境，使分离的动物细胞在体外生存、增值，并维持其结构和功能的一种培养技术。基本概念组成：原代培养、传代培养、细胞系、细胞株原代细胞：将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。传代细胞：传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。细胞系：是由原代培养经传代培养纯化，获得以一种细胞为主的、能在体外长期生存的细胞群体。细胞株：是指从一个经生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增值形成的细胞群。动物细胞培养的基本条件一、适合的培养基原因：培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增值的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的主要成分：氨基酸、糖类、无机盐、维生素及其他辅助物质。氨基酸：是组成蛋白质的基本单位，有一部分氨基酸动物细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供糖类：是细胞生长主要能量来源（葡萄糖）无机盐：主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡动物细胞培养的基本条件优质血清目的：添加血清来补充合成细胞培养液中缺乏的细胞生长所需的多种生长因子及其他营养成分，血清的质量、种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，特别是对克隆细胞的生长影响明显。无菌无毒细胞培养环境1、使用层流超净工作台是最经济有效的手段；2、利用高压灭菌装置进行灭菌；3、培养液采用微滤除菌，原代采用多种消毒剂进行交叉表面杀菌；恒定的细胞生长温度和酸碱度哺乳动物的体温分布：35.5~39.5℃鸟类：40~43℃温度的影响：1、39℃时人体细胞1h后就可以发现有部分细胞受到损伤（有可能恢复）；2、40~41℃培养1h后，细胞会普遍受到损伤（约半小时后可能恢复）；3、41~42℃培养1h，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡；4、温度达到43℃以上，培养1h细胞全部死亡.酸碱度的影响及培养范围成纤维细胞：喜欢较高pH(7.4~7.7)传代细胞系：则需要偏酸pH(7.0~7.4)培养液中常用的缓冲液：碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2进行缓冲；例如：NaHCO3加入量为2g/L，则CO2的浓度就需要调整到5%。注：在细胞培养瓶中培养，切记勿将瓶盖拧得太紧，以保证充分的气体交换。适合的气体环境主要气体有：O2、CO2。O2作用是用来氧化分解糖、脂肪等碳源物质以释放其中储藏的化学能量；CO2由于培养基中的动物细胞培养已经适应了CO2的高浓度，并且CO2还可以起到缓冲的作用。动物细胞形态从细胞形态分：主要有成纤维型细胞和上皮型细胞两类。成纤维型细胞：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。上皮型细胞：在培养皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有圆形核，细胞紧密相连单层膜样生长。哺乳动物细胞冷冻保存目的：保存种子细胞，以便随时取用是保存动物细胞的最主要目的。可以减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变，避免有限细胞系出现衰老或恶化转化，减少频繁传代，降低人力和物力。影响因素1、冷冻过程要缓慢2、冷冻细胞必须处在对数生长期，活力大于90%，无微生物污染。3、细胞浓度控制在1⤬107~5⤬107/ml.4、使用高浓度血清或蛋白保护剂（常采用20%血清的培养液进行细胞保存）5、使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。常用的细胞冷冻保存液（一）10%DMSO+完全细胞生长培养液（20%血清+基础培养液）。（二）10%甘油+完全细胞生长培养液（20%血清+基础培养液）动物细胞的解冻复苏目的：将冷冻保存的细胞进行解冻复苏，用于实验。注意事项:1、在操作时需戴手套，并且迅速完成；2、操作时用镊子将细胞从液氮中取出；3、解冻过程需轻拿轻放；4、需待冷冻液全部融化后，才可离心出去冷冻液；5、用新鲜培养基清洗1~2次，以达到完全除去DMSO等冷冻剂。置于CO2培养箱37℃进行复苏培养。动物细胞的传代培养细胞生长类型贴壁依赖型：来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长，只要其未转化为非贴壁依赖型的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，才能生长。非贴壁依赖型：无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞，来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖型的，大多呈圆形。贴壁依赖型细胞生长特性贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期，一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。贴壁主要