实验8污水中噬菌体的分离与效价测定重点.ppt

实验七 污水中噬菌体的分离、纯化与效价测定 实验目的 掌握噬菌体分离的基本原理和方法 学会观察噬菌斑 了解噬菌体纯化、效价测定方法 基本原理 噬菌体是专性寄生物，必需寄生细菌才能繁殖，伴随细菌的分布而分布，只要有细菌的地方，就有噬菌体 噬菌体颗粒可以在环境中独立存活，但不能繁殖 噬菌体对宿主的寄生通常具有特异性 温和噬菌体和烈性噬菌体 烈性噬菌体在液体中，可以使浑浊的菌液变为澄清 烈性噬菌体在固体琼脂平板，可以形成透明的噬菌斑 利用噬菌体斑的特征可以分离、纯化、效价滴定 噬菌斑的形成 在固体琼脂培养基上，噬菌体感染细菌后，在宿主细胞内进行核酸和蛋白质的生物合成，最后装配成噬菌体完整的颗粒，通过裂解宿主细胞释放出来，使感染的细菌不能生长，从而形成肉眼可以观察到的透明或浑浊的空斑，称为噬菌斑。 噬菌体的初次分离 将可能含有宿主菌的材料在液体培养基中过夜培养，然后将液体培养液过滤除菌，滤液备用。 将宿主菌涂布在平板表面，自然干燥。 取滤液10μl滴在平板上，过夜培养，如果有针对该宿主菌的噬菌体，则可以看到透亮的抑菌圈。 问题 如果采用这种方法，看不到抑菌圈，可以 说明的是哪些情况？ 如何进行噬菌体的纯化 挑取单一清晰可见的单个噬菌斑，接种液体培养基，并加入相同指示菌，重复上述从加入氯仿开始的各个试验步骤，得到噬菌斑 重复多次，可以得到由一个噬菌体的后代形成的噬菌斑，即获得了纯化的噬菌斑。 观测噬菌斑的特征 如何测定噬菌体的效价 效价指1ml培养液中所含有活的噬菌体的数量 采用双层琼脂平板法，进行噬菌斑的计数，计量单位为pfu，即plaque forming unit(噬菌斑形成单位）。 获得的噬菌体滤液作10倍的倍比递减稀释 取每个稀释度噬菌体0.1ml加入0.9ml的指示菌，混匀后，加入到上层琼脂，倾注平皿，选择30－300个pfu的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体原液的效价。 噬菌体的分离操作程序 于100ml 3倍浓缩肉汤加入污水样本200ml和大肠杆菌指示菌2ml 37°C培养8小时 取上述混悬液5ml接种到20ml的新鲜的LB液体培养基，并加入125ul丝裂霉素，37 °C培养18小时。 无菌取上述培养液1ml于1.5ml Eppendrof管中，加入200ul氯仿后振荡15min，4 °C 4000g离心20min，上清过滤，取滤液。 培养指示菌大肠杆菌MC1061 18小时 将细菌涂布在平板培养基表面，然后将滤液滴加到平板表面，过夜培养，观察结果。 肉眼如何判定噬菌体是否已经纯化？ 每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌体，要获得单一的噬菌体，必需进行噬菌体的纯化。 噬菌体效价的测定（以下开始自己做） 仔细观察提供的平皿，选取边缘清晰的单个噬菌斑 用灭菌移液器枪头轻轻挑取噬菌体斑到装有1ml培养液的1.5ml Eppendrof管中，震荡2-3分钟。 采用1ml 针筒吸取1ml 混合液，于0.22um滤膜过滤。 滤液收集在一个新的无菌1.5ml Eppendrof管中，获得噬菌体滤液的原液。 每组取7个1.5ml 的Eppendrof离心管，分别标注 10-1、10-2、 至 10-7。 每个Eppendrof离心管分别各加900ul LB，从噬菌体滤液中取100ul 于10-1离心管中，混匀后，取100ul 于10-2离心管中，依次类推10倍倍比递减稀释至-7。（一个移液枪头用到底） 操作程序 另取4支无菌的Eppendrof离心管，分别标记10-6 、 10-5、10-4、 10-3（注意次序），从上述相对应的各稀释管中分别取300ul 噬菌体液，然后各管加300ul 指示菌，37 °C温箱15min。（每组可以使用4个移液枪头，注意次序，不能混淆 ） 取上层琼脂，融化并孵育在48°C（已经融化），每人1支，加入上述10-6 、 10-5、10-4、 10-3其中一个稀释度的噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀5min。（特别注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂会凝固，但琼脂不能太烫，不能剧烈振荡） 立即倒入底层琼脂平板，室温5－10分钟，待上层凝固后，将平板倒置，作好标记。 37 °C 18小时观察结果 记录噬菌斑的数量 选择30－300个pfu的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体原液的效价。 与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应，计算噬菌体的含量 要 求 星期三(四） 12：00观察结果 描述噬菌斑特征，并计数 （包括噬菌斑的分布数量、形态特征） 实验报告 实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 p39 (1) 、 (2)、 (4) 、 (5) 下次实验 实验 动物病毒的培养