新植物遗传转化分析.pptxVIP

第十七章：植物遗传转化植物遗传转化（plangenetictransformation):应用重组DNA技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获得新植株的技术。第一类：外源裸露基因的直接导入法；通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物基因组中。基因枪转化法第二类：载体介导的转化方法；通过将目的基因连接在植物表达载体上，随着载体DNA的转移而将外源目的基因整合到植物基因组中。农杆菌介导转化法,病毒介导的转化法第三类：种质转化系统法；包括植物原位真空渗入法和花粉管通道法。Section1:植物遗传转化的方法（一）基因枪法基因枪法是指用钨粉或金粉包裹外源ＤＮＡ，而后依靠基因枪装置，利用高压氦气冲击波加速微弹去穿透植物细胞壁和细胞膜，使外源ＤＮＡ进入植物细胞并整合到植物细胞染色体组中，从而达到稳定遗传和表达的目的。（1）原理：基因枪法把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器。气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用。气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构，在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa，具有相应不同的可破裂膜，将包覆DNA的粒子穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中。（2）程序与方法：①轰击微弹的制备②基因枪轰击参数③受体材料④轰击样品①（3）基因枪法优缺点基因枪法优点：①无宿主限制②受体类型广泛③质粒构造简单基因枪法缺点：①仪器设备，轰击微弹的制备等较为昂贵②整合的外源基因拷贝数不易控制③轰击对细胞损伤大等（二）农杆菌介导法（1）原理：农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细后，可将T-DNA插入到植物基因中。农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。（2）方法：人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。（3）转化步骤可简单概括为以下方面：1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定（这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步）几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。农杆菌介导的过程（4）优缺点农杆菌介导法优点：①转化频率较高。②转移的外源片段较大。③整合的外源基因多为单拷贝。④整合到植物基因组的外源基因可以定向表达。农杆菌介导法缺点：①受体植物基因型限制。②农杆菌是一个生物有机体，转化受植物材料的影响大。（三）其他常用的转换方法（1）植株原位真空渗入法（2）聚乙二醇法（3）脂质体介导法（4）电击法（5）体内注射法（6）碳化硅纤维介导法Section2:转化植株的检测以报告基因检测为例：报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：Section3:几种植株遗传转化的技术（一）大田作物遗传转化的技术①油菜的遗传转化技术农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。外源基因直接导入法：有点击法、PEG法、显微注射法、花粉介导法等。②棉花的遗传转化技术农杆菌介导法花粉管通道法基因枪法农杆菌介导法转化棉花（二）园艺植物遗传转化技术①黄瓜遗传转化黄瓜遗传转化的方法与结果发根农杆菌介导根瘤农杆菌介导花粉管通道floraldip法②花椰菜遗传转化十字花科，具有良好的再生能力。花椰菜遗传转化方法如图：发根农杆菌介导根瘤农杆菌介导（三）林木遗传转化的技术目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、耐旱等方面。（四）药用植物遗传转化的技术主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子极少。