5.4.沉淀法解决方案.pptVIP

一、沉淀法概述 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。 任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。 沉淀和结晶的区别: 形态 成分纯度 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。 沉淀法操作步骤 ： ①加入沉淀剂; ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取。 优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产； 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。 eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。 沉淀法分离蛋白质的特点： 生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。 二、蛋白质的溶解特性 蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。 蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。 吸引力 DLVO理论 三、蛋白质沉淀方法 1、中性盐盐析法 在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低ζ电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。 中性盐盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象 ——低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。 （2）“盐析”现象 ——高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降。 中性盐盐析法 ⑴、离子强度对盐析过程的影响 Cohn经验公式 S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 β和Ks的物理意义 β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 ⑵、用盐析法分离蛋白质的二种方法 用盐析法分离蛋白质的二种方法 ⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。 （β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。） 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 ⑶、盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱； （Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁 选用盐析用盐的几点考虑 盐析作用要强； 盐析用盐需有较大的溶解度； 盐析用盐必须是惰性的； 来源丰富、经济。 常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸铵在水中的溶解度很高但具腐蚀性，硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。 Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。 阴离子：柠檬酸根-3酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-； 阳离子：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+ Rb+NH4+K+Na+Li+。 ⑷、影响盐析的因素 溶质种类的影响：Ks和β值 溶质浓度的影响： 蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系pH值，使其在pI附近； 盐析温度： 一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降 2、等电点沉淀法 蛋白质等电点沉淀法是