PCR_引物或者产物的磷酸化反应和平端连接的经验.docVIP

T4 多聚核苷酸激酶 T4 Polynucleotide Kinase 该酶能够催化磷酸在ATP的γ-位和寡核苷酸链（双链或单链DNA或RNA）的5-羟基末端的磷酸化，以便进行连接反应。?它的缓冲液为:70 mM Tris-HCl pH 7.6 , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT,在液中加入终浓度为1 mM的ATP，37°C温育1 小时。该酶在新鲜缓冲液中表现最适酶活力（在旧缓冲液中，由于DTT氧化而造成的实际DTT含量减少会降低酶活力）。要提高5平滑末端或5凹陷末端的磷酸化效率，可在加T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液于70°C加热5分钟，然后冰上冷却，或者加入5% W/V 的PEG-8,000。?由于T4多聚核苷酸激酶可被铵离子所抑制，所以磷酸化步骤前，DNA不要在含铵离子的溶液中沉淀。热失活条件: 65°C 加热20分钟。 平末端连接构建载体的一些个人经验 - 2006/08/20 21:33 载体和插入片段DNA的量都要比黏末端连接时的用量多，可以增加到5倍以上。 2、载体务必去磷酸化处理 许多公司都有这类酶，比如NEB的CIP 点击进入产品页面 3、如果是PCR生成插入片段，要用产生平端片段的PCR酶 如PFU ，必须磷酸化5末端，可以磷酸化引物，也可以磷酸化产物，我一般磷酸化产物，这一步最关键也最容易遗漏 请参考T4PNK 点击进入产品介绍 。普通Taq酶PCR以后可以补平再做连接，但是仍然需要磷酸化，当然如果是PCR以后再酶切成平端那和普通酶切片段是一样的。 4、按照分子克隆第三版介绍，如果线性化载体时所用的内切酶在插入片段序列内没有位点，酶切和连接可以在一个反应体系内同时完成 相关内容请查阅分子克隆III ，但是我的实验证明这个方法效率并不高。我建议采用下面方法：酶切载体- 分离片段- CIP- 插入片段磷酸化- 纯化片段- 按照正常连接反应，体系内加入线性化载体所用内切酶，按照酶切1/10浓度加入。这样基本上可以完全阻断载体自连接 因为凡是载体自连都将被酶切再次线性化，而插入片段形成新质粒则不会被酶切 ，提高连接效率。 5、连接酶用量也要适当增加，建议用高浓度连接酶T4 DNA ligase 点击连接产品页面 ，不要用快速连接方法。 6、连接体系是否加入PEG，好象没有显著差别，另外PEG分子量也没有特殊要求，PEG4000到PEG8000都曾经出现在公司药合里面。  37度30min连接效率我还真是不太懂，而且离开具体的实验条件谈连接效率我觉得也没有多大意义，因为最终的转化子数和期望重组子比例受太多因素影响，（质粒自连反应的影响因素较少，倒是可以以此为实验模型讨论）而不仅仅是连接温度和时间。不过还望stone网友给出有出处的定义。对于连接反应，实验条件早有定论。一般都是采用公司产品目录上的推荐条件，37C时?T4DNA连接酶的活性一般最高.但因为粘端的互补氢键结合容易因分子热运动脱开。所以折衷为16C?反应，还有人建议用PCR仪作连接，低温粘端退火，然后高温连接（没有实验数据，但还讲得出道理）。平端连接的推荐温度是22C，分子克隆为20C，酶量要加大100倍，反应液中加入PEG和六氯高钴合氨等可以刺激连接。至于反应时间，一般是16小时，不过也有公司产品目录上说2－3小时。因此，我的体会是如果做常规克隆，如Phdlifei网友所言，只要其他的操作没问题的话，连接条件可以比较随意。我一般就是粘端室温2-3h，平端22C?16小时。如果结果不好的话，应该是其他操作造成的。TA克隆更偏向于粘端连接,?生工的产品目录上的反应条件就是16C?2小时到过夜。PCR产物和载体进行连接时都需要磷酸化吗？如果载体没有经过去磷酸化处理，PCR产物就没必要磷酸化。一般PCR产物克隆到T载体，显然我们不会对T载体去磷酸化处理，所以就不需要磷酸化处理。“如果PCR产物和载体都是经过双酶切的应该就不用磷酸化了吧？”PCR产物和载体都是经过双酶切后，都有磷酸基了，不需要再磷酸化。“如果是PCR产物直接与T载体进行连接需要磷酸化吗？”如上，载体有磷酸基，“载体去磷酸化什么情况要做呢？”为了减少载体的自连，采用去磷酸化。比如单切后克隆片段，一般载体去磷酸化可以减少假阳性。还有用高保真酶扩增的片段与平末端酶切的载体（如用EcoRV 的链接，为了减少自连载体一般去磷酸化，那么扩增的片段就要磷酸化。我们一般合成的引物两端都是0H基，这种情况就要磷酸化，或要求生物技术公司在合成引物时引物磷酸化，价格有点高，02年大概要300RMB,现在的行情不太清楚。