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第六章 生产菌种 的生产 第一节 种子制备过程 一、孢子的制备 （一）放线菌孢子的制备 采用琼脂斜面培养基，培养基中含适合产包子的麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无机盐等，碳源和氮源不要太丰富。温度28或37℃，培养5～14天。 （二）霉菌孢子的制备 以大米、小麦、玉米、麸皮等天然农产品为培养基。温度25 ～ 28℃，培养4 ～ 14天。 （三）细菌孢子的制备 细菌的斜面培养多采用限制碳源而氮源丰富的牛肉膏、蛋白胨培养基。温度37 或28℃，培养5～10天。 放线菌发酵生产的工艺流程 菌种 母斜面 子斜面 摇瓶种子 种子罐 发酵罐 第二节 种子质量的控制 种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。 一、影响孢子质量的因素及其控制 孢子质量与培养基、培养温度、培养时间和接种量等因素有关，这些因素相互联系、相互影响。 （一）培养基 原材料的质量 水 （二）培养温度和湿度 1.温度 获得孢子的最适温度范围区间很窄。 例如：龟裂链霉菌斜面的最适温度为36.5～37℃。 2.湿度 北方湿度控制在40～45％，南方湿度控制在35～42％，所得孢子质量好。一般来说，真菌对湿度要求高，放线菌对湿度要求低。 （三）培养时间和冷藏时间 丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为五个阶段：孢子发芽和基质菌丝生长阶段、气生菌丝生长阶段、孢子形成阶段、孢子成熟阶段、斜面衰老菌丝自溶阶段。 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导致生产能力下降。 孢子冷藏的时间宜短不宜长。 二、影响种子质量的因素及其控制 种子质量重要受孢子质量、培养基、种龄和接种量等因素影响。摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度和黏度以及糖代谢、pH变化为指标。 （一）培养基 易于被菌体直接吸收和利用，营养成分适当丰富和完全，氮源和维生素含量较高，总浓度较细薄。 （二）培养条件 温度 pH 通气搅拌 细菌 7～24小时 霉菌 16 ～50小时 放线菌 21 ～64小时 （五）种子质量标准 细胞或菌体（菌体形态、浓度、培养液外观） 生化指标（糖、氮、磷含量的变化和pH) 产物生成量 酶活力 （六）种子异常分析 菌种生长发育缓慢或过快 菌丝结团 菌丝粘壁 （七）种子质量的控制措施 种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率体现的。因此必须保证生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌浸入，从而获得优良的种子。 菌种稳定性的检查 生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可少的一项工作。 方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。 这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。 杂菌检查 在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等等。 作业 影响种子质量的因素及其控制 母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。 子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。 孢子培养时注意湿度，且子斜面使用一般不超过1个月 （四）接种量 种子的质量要求： 量：要求达到一定的浓度 质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH、酶活等 无污染 （三）种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及菌体太少,菌丝结团； 种龄长：生产能力下降。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。 （四）接种量 移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积 大接种量可加速产物的形成，但会导致菌体