质谱联用法测定人血浆辛伐他汀.pptVIP

超高效液相色谱-质谱/质谱联用法测定人血浆中的辛伐他汀 辛伐他汀及其特点 辛伐他汀(simvastatin)是一种新型的调血脂药,临床上主要用于治疗原发性胆固醇血症 辛伐他汀为前体药物,因此测定其血药浓度较血中含量低,因此测定其血药浓度比较困难 本实验方法利用了UPLC-MS/MS（超高效液相色谱-串联质谱）法测定人血浆中的辛伐他汀的方法,该法灵敏度高,分析速度快,操作简便,适于需高通量分析的药物动力学及生物等效性研究。 实验思路 仪器 美国Waters公司ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪; 美国Waters公司Waters Quattro micro API三重四极杆串联质谱仪,配备电喷雾离子源(ESI)和Masslynx4·1数据采集软件。 试剂 辛伐他汀标准对照品 洛伐他汀标准对照品 乙腈为色谱纯,购自TEDIA公司 乙醚、正己烷、异丙醇均为分析纯 空白血浆 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(50mm×2·1mm,1·7μm,美国Waters公司),流动相:乙腈-10mmol/L乙酸铵水溶液(体积比为85∶15),流速:0·25mL/m in,柱温:40℃,进样量:20μL 质谱条件 离子源: ESI 正离子检测模式 扫描方式:多反应监测(MRM) 定量分析时的离子反应为m/z419·2→m /z199·0(辛伐他汀)和m /z405·0→m /z199·0(内标洛伐他汀) 扫描时间为0·10s 毛细管电压:3·0kV 锥孔电压:20V 去溶剂气:氮气，温度:350℃，流速:500L/h 源温度:110℃ 碰撞诱导解离电压:15eV 配制不同浓度的辛伐他汀标准溶液 辛伐他汀及质谱分析图 一级全扫描质谱图中获得辛伐他汀准分子离子峰[M+H]+m /z419·2,选择性对[M+H]+进行二级质谱分析,准分子离子裂解生成的主要碎片离子为m /z199·0,用于定量分析 内标洛伐他汀及质谱分析图 内标洛伐他汀产物的离子全扫描质谱图,准分子离子峰[M+H]+为m /z405·0,准分子离子裂解生成的主要碎片离子为m /z199·0,用于定量分析。 基质效应 取人血浆500ml，除不加系列标准溶液和内标外，按曲线制备操作方法操作，向上层清液中加入内标溶液和相应浓度的系列标准溶液各100μL,涡流混合,于40℃下用氮气流吹干,残渣用150μL流动相溶解,用20μL进样分析,获得相应的峰面积A;取内标溶液和相应浓度的系列标准溶液混合,于40℃下用氮气流吹干,残渣用150μL流动相溶解,进样20μL,获得相应的峰面积B。以A /B考察方法的基质效应,结果表明本方法无基质效应。 方法的专属性 结果 血浆内源性物质不干扰辛伐他汀的测定。 数据表明本方法符合FDA实验要求 回收率 取人空白血浆500μL,按曲线制作项下操作,制备辛伐他汀低、中、高3个浓度的质量控制样品,每一浓度进行5份样本的分析 同时另取人空白血浆500μL,按基质效应项下的方法操作,向上层清液中加入内标溶液和相应浓度的系列标准溶液各100μL,涡流混合,于40℃下用氮气吹干,残渣用150μL流动相溶解,取20μL进样分析,获得相应的峰面积 分别为89·9%,89·4%和95·4%,平均为91·6%。 稳定性结果 按曲线制备项操作,制备低、中、高3个浓度的QC样品 考察血浆样品经预处理后于4℃条件下放置的稳定性、血浆样品于室温下放置的稳定性以及血浆样品经过3次冻-融循环及长期放置的稳定性。 药动学研究中的应用 20名受试者口服辛伐他汀胶囊40mg,分别于服药前和服药后0·5,1·0,1·5,2·0,2·5,3·0,4·0,5·0,6·0,8·0,12·0,24·0h由前臂静脉取血3mL,分别置于肝凝素处理的离心试管中,离心(3 500r/m in)15m in,分离血浆,存放于-70℃冰箱中冷冻待测。 平均血药浓度-时间曲线 实验过程中,考察了乙醚、乙酸乙酯、乙醚-正己烷，环己烷-异丙醇，乙醚-正己烷-异丙醇6种提取溶剂的提取效果,其中乙醚-正己烷(体积比为80∶20)和乙醚-正己烷-异丙醇(体积比为80∶20∶3)2种混合试剂一次提取的回收率较高，加入少量的异丙醇,可减少样品处理过程中乳化现象的产生，故选择乙醚-正己烷-异丙醇 在样品预处理过程中，酸化试剂表明pH4·5的乙酸铵溶液的提取效率最佳 本方法的优点 本法同高效液相色谱-紫外检测法相比，灵敏度高,分析时间短 本方法分析一个样品仅需2.0m in,每天可分析300个生物样品 建立的UPLC-MS/MS法非常适于需高通量分析的辛伐他汀药物动力学及生物等效性