染色质免疫沉淀说课.ppt

* 在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。 * 染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，比如Millipore公司的ChIP Validated抗体等。 应用的抗体必须与它的目的蛋白在缓冲液中及淋洗过程中呈特异性紧密结合。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀（Immunoprecipitation）检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。 * 阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。另外考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能，通常还会选择一对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。 染色质免疫沉淀 Chromatin immunoprecipitation 基因型决定表型 破坏了基因型也就改变了表型 但是，也有一些无法解释的现象 在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况下，一些生物体的表型却发生了改变。 什么是表观遗传学? 是DNA及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的变化并不涉及DNA序列的突变。 表观遗传修饰 在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰，不仅可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的孪生子出现个体差异的主要原因。 染色质重塑 染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质DNA与其包绕的核心组蛋白之间亲和力的变化或相对位置的改变使得染色质结构变得较为松散，DNA更易于暴露。染色质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。 在狭义上，染色质重塑专指由ATP提供能量的、通过依赖于ATP的染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA的结合状态，在靠近核心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象，使转录因子较易于接近DNA的过程。 染色质免疫沉淀技术的发展使染色质重塑研究得以进步 实验目的 学习掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理与关键的操作步骤。 实验原理 实验流程 一、交联及染色质DNA剪切条件的优化 准备一瓶接近长满的HeLa细胞，向培养液中加入37%的甲醛至终浓度为1%，轻轻摇匀，在37℃孵育10分钟。 ① 甲醛的作用 ② 细胞的用量 ③ 交联条件对实验结果的影响 弃培养液，用预冷至4℃带蛋白酶抑制剂PMSF的1×PBS洗细胞两次，刮细胞到一个2ml离心管，2000rpm，4℃离心4min收集细胞。 甲醛的作用 在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛终浓度为1%，在12-37℃作用30min。但是如果反应温度超过30℃，本底就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想长度的DNA片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。 细胞的用量 通常2.5×108细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量，采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计数。（一般分装1х107细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。 交联条件对实验结果的影响