5微生物的菌种选育2要点.ppt

工业微生物 5.2.2 基因突变和诱变育种 在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围 蛋白酶水解圈的大小、 淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小， 氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小， 柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小， 抗生素抑制圈的大小， 指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生）， 纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小， 外毒素的沉淀反应圈的大小等， 均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态”指标。 （7）设计高效筛选方案 设计简便、高效的科学筛选方案。 初筛 筛选工作 复筛 以量为主（选留较多有生产潜力的菌株） 以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定） 常用的筛选方案 第一轮： 第二轮： 第三轮： 同第二轮 第四轮： 同上 . . . 直至获得较满意的结果为止 初 筛 复 筛 对产量突变株生产性能的测定方法 粗测为主 在培养皿平板上 在摇瓶中 （8）创造新型筛选方法 较精确的测定 摇瓶培养or台式自控发酵罐培养 3. 3类突变株的筛选方法 （1）产量突变株的筛选 1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生产菌时所采用的一种琼脂块培养法，一年内曾使该抗生素产量提高10倍。 此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。 数据精确，效率高 （2）抗药性突变株的筛选 基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。 特点： 正选择标记 （突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。） 梯度平板法（gradient plate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。 梯度平板法（gradient plate） 是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。 表示方法： 所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”。 strr strs 对链霉素的 抗性 敏感性 （3）营养缺陷型突变株的筛选 营养缺陷型突变株（auxotrophic mutant）在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。 a. 基本培养基（MM，符号为［－］） ① 与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MM。 b. 完全培养基（complete medium，CM，符号为［＋］） 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为CM。 一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。 c. 补充培养基（supplemental medium，SM，符号为［A］或［B］等） 凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为SM。 在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。 原养型（prototroph） ② 与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体 野生型（wild type，wild strain） 营养缺陷型（auxotroph） 从自然界分离到的原始菌株（A＋B＋） 经诱变剂处理后的突变株（A—B—） 经回复突变或重组后产生的菌株（A＋B＋） ③ 营养缺陷型的筛选方法 第一步，诱变剂处理 第二步，淘汰野生型 第三步，检出缺陷型 第四步，鉴定缺陷型 淘汰野生型的方法 （1）抗菌素法 青霉素 制霉菌素 （2）菌丝过滤法 第三步，检出缺陷型 对照培养法 夹层培养法（layer plating method） 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法 ①对照培养法 CM MM SM ②夹层培养法 MM CM MM＋菌液 ⑥ 如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常： ⑤ 增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常： (3)染色体畸变（chromosomal aberration） 电离辐射（X射线等） 烷化剂 亚硝酸等 某些强烈理化因子 引起 点突变 DNA的大损伤（macrolesion） DNA的大损伤（macrolesion） 染色体畸变 缺失（deletion） 重复（duplication） 插入（insertion） 易位（t