S1PR1参与HDL介导THP1源性巨噬细胞胆固醇流出及其机制.pdf

目 录 中文摘要 1 英文摘要 3 论文正文 5 前 言 5 第一部分 THP-1 源性巨噬细胞 S1PR1 对细胞内胆固醇流出的影响 1. 材料与方法 7 2. 实验结果 12 3. 实验小结 14 第二部分 S1PR1 影响细胞内胆固醇蓄积和流出的信号机制 1. 材料与方法15 2. 实验结果 22 3. 实验小结 28 讨 论 29 结 论 31 参考文献 32 英文缩略语索引 37 综 述 38 硕士期间发表的论文 50 致 谢 51 万方数据 1 S1PR1参与 HDL介导的 THP-1源性 巨噬细胞胆固醇流出及其机制 研究生：张大棣 导 师：易光辉 教授 专 业：病理学与病理生理学 中 文 摘 要 背景与目的：1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-Phosphate, S1P）是鞘磷脂代谢的中 间产物之一。对动脉粥样硬化等心血管疾病中的发生和发展起着重要的作用。是目 前颇受关注的脂质信号分子，是溶血磷脂的中间代谢物，广泛存在于血液、淋巴液、 红细胞、中性粒细胞、血小板等体液和细胞中，在体内具有众多生物学作用。S1P 的这些作用，或通过其本身直接产生细胞内效应，或通过其特异性受体影响细胞内 信号转导途径产生作用。S1P 受体（S1PR）属于 G蛋白偶联受体家族成员，目前人 们已经发现了它的 5 种亚型，即 S1PR1-5。S1PR1主要与 Gi偶联，不同的 G 蛋白介 导了细胞内不同的信号转导途径，产生不同的生物学效应，因此，S1P 与其不同亚 型受体作用可以激活不同的信号转导途径，产生各种各样的生物学效应。但有关 S1PR1 对巨噬细胞内胆固醇代谢的影响未见报道。因此，本论文主要探讨 S1PR1 参 与 HDL介导的 THP-1 源性巨噬细胞胆固醇流出及其机制，为全面了解 S1PR1 的抗 动脉粥样硬化机制提供新的理论基础。 方法：1.佛波酯 (Phorbol-12-myristate-13-acetate , PMA)诱导 THP-1单核细胞 24 h 后，选择不同时间和浓度的 oxLDL 进行处理，人胆固醇 Elisa 试剂盒检测细胞培 养液中胆固醇含量。2. 分别用 50μg/ml HDL、VPC23019 (S1PR1 抑制剂，10 μM) ， 孵育 THP-1源性巨噬细胞 12 h，然后加 BODIPY-Cholesterol 孵育过夜，高效液相色 谱仪检测细胞内胆固醇含量变化，同时加 50μg/ml HDL 共孵育，以 5μΜ BODIPY 荧光标记胆固醇细胞内脂质蓄积变化。3. VPC23019 (10 μM) 、siRNA 处理 THP-1 源性巨噬细胞 24 h 后，Western Blot 检测 ABCA1 对蛋白表达情况。4. 分别用 S1P 、 VPC23019（S1PR1 抑制剂） 、LY294002（PI3K 抑制剂） 和 MK2206（Akt 抑制 万方数据 2 剂）来检测 S1PR1-PI3K-Akt信号通路对 LXRα表达的影响。5. T0901317(LXR 激动 剂) 、LY294002（PI3K 抑制剂） 、MK2206（Akt 抑制剂） 和 22S-HC（LXR 抑 制剂）来观察 S1PR1-PI3K- Akt-LXRα信号通路对 ABCA1的表达影响。 6. S1P 、 siRNA和 VPC23019（S1PR1 抑制剂）处理 THP-1源性巨噬细胞检测 S1P/S1PR1 对 Akt 磷酸化的影响。 7. 用 oxLDL 处理后 THP-1 源性巨噬细胞分别加入：S1P 、 VPC23019（S1PR1 抑制剂） 、T0901317（LXRα激动剂）和 22S-HC（LXRα选择 性抑制剂）检测 S1PR1 和 LXRα对细胞内胆固醇蓄积的影响。 结果：1. 60μg/ml oxLDL处理 THP-1 源性巨噬细胞 24 h，培养液中胆固醇含量 达到最高。2. THP-1源性巨噬细胞胆固醇大部分位于细胞胞膜上，HDL可降低THP-1 源性巨噬细胞内胆固醇含量；与HDL对照组相比，S1PR1抑制剂VPC23019使 THP-1 源性巨噬细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量显著提高，而 BODIPY 荧光检测结果示： VPC23019能明显降低介导的细胞内胆固醇的流出，表明S1PR1对S1P介导的THP-1 源性巨噬细胞胆固醇流出产生影响。 3. S1PR1 受体抑制剂 VPC23019 和 siRNA均 能显著降低 HDL诱导的 ABCA1的蛋白表达水平。 4. S1P 、VPC23019 、LY294002 和 MK2206 均能不同程度下调