重组体的选择与鉴定1要点.pptVIP

重组体分子的选择与鉴定方法及原理 何为重组体？ 转化子：在DNA分子克隆中，通常将导入外 源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子； 重组体：含有重组DNA分子的转化子； 目的重组体：含有外源目的基因的重组体。 为什么要对重组子进行选择与鉴定 在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子,因为在连接反应中会有以下几种情况发生: 载体和一个或数个串联目的基因连接 载体发生自连 目的DNA分子发生自连 未发生连接反应的载体和目的DNA片段 为什么要对重组子进行选择与鉴定 因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子的方案并加以验证。 常用的选择方法 直接选择法 遗传学表型筛选方法一—抗药性筛选 分类： （1）抗药性基因不失活 （2）抗药性基因失活 常用的抗药性选择标记： 氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cm） 卡那霉素（Kan）、四环素（Tet或Tc） 链霉素（Sm或Str） 抗药性基因不失活 基本原理： 外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。 抗药性基因不失活 实验步骤： （1）培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； （2）将转化后的菌液均匀涂布在平板上； （3）放在37℃培养箱培养12~16小时； （4）观察菌落生长情况。 抗药性基因不失活 抗药性基因失活 基本原理： 如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应 。 抗药性基因失活 例如： 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性基因失活, 携带这种质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长, 而不能在氨苄青霉素抗性平板上生长。 抗药性基因失活 抗药性基因失活 注意事项： （1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物时， 37℃培养时间约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。 （2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验 验证。挑的菌落在培养基中震荡培养。 遗传学表型筛选方法二β-半乳糖苷酶显色法 基本原理： 许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检测功能。 当外源DNA插入到它的lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶）上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。（X-gal是β-半乳糖苷酶的显色底物） 遗传学表型筛选方法二β-半乳糖苷酶显色法 举例： pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。 大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。 在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的β-半乳糖苷酶片段都没有活性。 遗传学表型筛选方法二 β-半乳糖苷酶显色法 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。 遗传学表型筛选方法二β-半乳糖苷酶显色法 遗传学表型筛选方法二β-半乳糖苷酶显色法 注意事项： （1）由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长 时间，因此，观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。与37℃温箱取出后放4 ℃冰箱几小时后观察效果更好； （2）为了防止假阳性需挑菌进一步验证。 间接选择法 依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一快速裂解菌落鉴定分子大小 基本原理：