蛋白质一级结构测定解决方案.ppt

多肽链的末端分析 酶解法测定顺序：利用外肽酶（N-肽酶和C-肽酶）对蛋白质从N-端或C-端进行逐个氨基酸的水解，从氨基酸的释放顺序测定氨基酸的排列。此法在酶解时，往往在肽链的第一个氨基酸还没有释放完全时，第二个氨基酸已经开始释放，必须用氨基酸释放时间与氨基酸释放量的关系做图，才能求出氨基酸在肽链中的顺序。但有时也会出现第二个氨基酸释放速度与第一个氨基酸释放速度相同的现象，在这种情况下将不能用此法测定。 到目前为止，没有任何一种可以测定超过50个氨基酸残基的方法。而且随着肽链的延长，测定的准确性会大大的降低。因此，都是将蛋白质水解为小肽段，再测定小肽段的顺序，最后将小肽段拼接为完整的蛋白质的一级结构。 当蛋白质水解后，产生了水解位点的n+1个水解片段。提纯分离后，这些片段的位置被打乱，Sanger利用两套水解片段重叠法，最终解决了这一难题。 部分水解肽段的顺序确定 N-赖谷苏丙丙丙赖苯谷精谷胺组蛋天丝丝苏丝丙丙丝丝丝（天胺）酪半（天胺）（谷胺）蛋蛋赖丝精（天胺）亮苏赖天精半赖脯缬（天胺）苏苯缬组谷丝亮丙天缬（谷胺）丙缬半丝（谷胺）赖（天胺）缬丙半赖（天胺）甘（谷胺）苏（天胺）半酪（谷胺）丝酪丝苏蛋丝异苏天半精谷苏甘丝丝赖酪脯（天胺）半丙酪赖苏苏（谷胺）丙（天胺）赖组异异异缬丙半谷甘（天胺）脯苏缬脯缬组苯天丙丝缬-C 胰蛋白质酶水解片段 N-赖 苯谷精 谷胺组蛋天丝丝苏丝丙丙丝丝丝（天胺）酪半（天胺）（谷胺）蛋蛋赖 谷苏丙丙丙赖 丝精 （天胺）缬丙半赖 酪脯（天胺）半丙酪赖 苏苏（谷胺）丙（天胺）赖 （天胺）甘（谷胺）苏（天胺）半酪（谷胺）丝酪丝苏蛋丝异苏天半精 组异异异缬丙半谷甘（天胺）脯苏缬脯缬组苯天丙丝缬-C （天胺）亮苏赖 天精 半赖 谷苏甘丝丝赖 脯缬（天胺）苏苯缬组谷丝亮丙天缬（谷胺）丙缬半丝（谷胺）赖 糜蛋白质酶水解片段 N-赖谷苏丙丙丙赖苯 半（天胺）（谷胺）蛋蛋赖丝精（天胺）亮苏赖天精半赖脯缬（天胺）苏苯 缬组谷丝亮丙天缬（谷胺）丙缬半丝（谷胺）赖（天胺）缬丙半赖（天胺）甘（谷胺）苏（天胺）半酪（谷胺）丝酪 丝苏蛋丝异苏天半精谷苏甘丝丝赖酪 脯（天胺）半丙酪 赖苏苏（谷胺）丙（天胺）赖组异异异缬丙半谷甘（天胺）脯苏缬脯缬组苯天丙丝缬-C 谷精谷胺组蛋天丝丝苏丝丙丙丝丝丝（天胺）酪 胰 谷胺组蛋天丝丝苏丝丙丙丝丝丝（天胺）酪半（天胺）（谷胺）蛋蛋赖 糜 半（天胺）（谷胺）蛋蛋赖丝精（天胺）亮苏赖天精半赖脯缬（天胺）苏 苯缬组谷丝亮丙天缬（谷胺）丙缬半丝（谷胺）赖（天胺）缬丙半赖（天 胺）甘（谷胺）苏（天胺）半酪（谷胺）丝酪 胰 丝精 （天胺）亮苏赖 天精 半赖 脯缬（天胺）苏苯缬组谷丝亮丙天缬（谷胺）丙缬半丝（谷胺）赖 水解肽段在一级结构中的位置，由已测定的两套或三套水解片段顺序，进行重叠确定。 （一）色氨酸的测定：色氨酸是组成蛋白质的重要氨基酸之一，在一些蛋白质的氨基酸组成的分析数据中经常缺少这个氨基酸的数据，这是由于酸水解时色氨酸几乎全部被破坏，可用碱水解法或酶水解法加以弥补，然后再进行测定。常用的方法有以下两种： （1）对-二甲基氨基苯甲醛法：含有色氨酸的碱水解液加入对-二甲基氨基苯甲醛的浓硫酸溶液和亚硝酸钠溶液，强酸条件下反应生成蓝色化合物，590nm测定光吸收值，此法现已被广泛应用。 （2）三价铁显色法： 含有色氨酸的样品，与铁离子的醋酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈玫瑰红色，在545nm比色测定。 此法测定简便、快速，线性关系较好。但反应混合物中的含水量对显色有一定影响。因此，不如对-二甲基氨基苯甲醛法使用广泛。 巯基的测定：巯基在蛋白质的结构与功能的研究中比其它基团更为重要，因此更引起人们的注意。测定巯基的方法有很多，不能说那一方法最好，由于pH、缓冲液、巯基与试剂反应能力以及蛋白质分子的变性程度等因素的影响，必须比较不同方法的分析结果之后才能得出正确的结论。 主要方法有：形成硫醇盐法、烷基化法、比色法等，给大家介绍形成硫醇盐法。 （1）形成硫醇盐法：重金属与巯基反应生成硫醇盐衍生物 蛋白质—SH+Me+ 蛋白质—S Me+H+这些金属离子主要有：银、汞、铜、镉、锌铅等。一般，采用不同量的金属离子滴定巯基，并用电位测定法测定过量的试剂。 对氯汞苯甲酸与巯基反应，形成巯基的对氯汞苯甲酸衍生物（PCMB）。PCMB最大吸收在233nm摩尔消光值为1.96×104。与巯基形成硫醇盐以后，增加到2.2 ×104从图中可以看出在250nm