WB的失败图要点.pptVIP

WB问题条带分析 报告人：杨羚 1、目的条带啥也没有 原因：只重复做没有思考。这次目的条带和内参的二抗种属是不同的。 网上查阅经验：一点没有，甚至连内参都没有，可能抗体加错了，转膜问题甚至膜放反； 条带细微接近没有，上样量少，一抗浓度低，显色液失效........... 解决办法：实验前检查抗体种属是否加错，确认转膜没有问题。重复做CST1只有点内参CST1重做 2、高背景JNk高效价第一次.bmp 原因：封闭不够好，洗膜不充充分，抗体浓度特别是二抗过高。 网上查阅经验：奶粉封闭时间够，注意操作规范，不偷工减料洗膜 实际解决方法：奶粉封闭时间延长了半个小时， 对于这种剪小后的片，用小洗涤盒洗，总之保证其洗膜充分JNK高效价第二次.bmp 3、出现许多黑点和斑 原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合。 网上查阅经验：不要封闭时才去匆忙配奶粉，要确保奶粉完全溶解,否则不溶颗粒附着膜上。溶解后静止，轻吸上层牛奶封闭，封闭结束，三次洗膜彻底 201507内参略成功.bmpirt3失败品 4、条带拖尾 可能原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长;个人猜测，跑胶的问题 解决办法：调整蛋白量，同时一抗浓度缩小和孵育时间缩短 201508-HSF-LXF..jpg 5、出现非均一性背景 原因：膜可能干过！ 解决办法：确保蛋白面不要被风干很长时间，一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子，防止过夜16个小时液体流失。 Gapdh.jpg 6、条带中出现规则白圈 原因：转膜出现气泡！ 网络经验：放膜时候，使膜U型放，两边下压； 盖海绵前，确定气泡除尽，盖后放置动作要小幅轻微，防止产生不必要的气泡。 7、最边缘条带弯曲 原因：电泳电流不均 解决办法：尽量不使用两边的两孔 BNP+Gapdh.jpg 8、其他电泳过程出现的问题现象 （1）整个条带呈 “ ︶ ” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。 （2）整个条带呈“ ︵ ”： 凝胶左右两头没有凝固好 （3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。 （4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒 （5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。 （6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。 8、配胶问题导致的失败——条带变形 原因：胶体中存在气泡，或不溶性杂质，胶不均不平整 解决办法：配胶的小烧杯，水，SDS，tris等等干净无杂质。贴边角加入液体，凝固时间避免大幅度动作触碰。 9、配胶问题导致的失败——条带哑铃状 原因：配胶问题，可能是插或拔梳子引起的凹凸不平整； 还有可能，样品含较多杂质杂质沉积空中间....... 10、其他 （1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。 （2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。 （3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。 ( 4 ).........