Exp08限制酶的酶切反应要点.pptVIP

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2016-08-04 发布于湖北
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Exp08限制酶的酶切反应要点.ppt

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实验八重组质粒的酶切鉴定一、实验目的器具和材料 ?1.5ml EP管,移液器及枪头(10、50?l) ?恒温水浴、电泳仪、电泳槽 ?pMD18-T重组质粒;质粒pUC19 试剂 1. 酶切反应 (4人/组) ?ddH2O→EP管→10?buffer→质粒DNA→限制酶→混匀,离心5s→37℃, 1h→终止反应 (1) 双酶切 (2) 单酶切 ?BamHI (15U/?l) ?30℃, 45? 2. 凝胶电泳检测 ?1%Aga,20ml,煮沸 ?冷却,加GelStain ?倒胶,凝固20? ?2?l上样液+10?l样品 ?80V电泳酶切失败的可能原因不全切或基本未切 ?缓冲体系不合适 ?酶量过多 ?样品杂质含量高 DNA被降解注意事项 ①冰上操作 ②吸量准确 ③最后加酶 ④勿触管盖内面五、作业思考题P140 2、5 1. 影响限制酶酶切的因素有哪些?使用工具酶时应注意什么? 2. 酶切反应中添加酶的量应控制在什么范围内,为什么? * 掌握质粒DNA酶切的方法与操作技术 ?EcoRI PstI 双酶切二、实验原理 ?BamHI 单酶切三、实验器具、药品 ?限制酶: BamHI、EcoRI和PstI ?酶切buffer: 10?K、10?H ?DNA marker: ?-HindⅢ ?琼脂糖,1?TAE, 上样buffer 四、实验步骤 1 1 10 2 6 需量(?l) PstI EcoRI DNA 10? H Buffer ddH2O 成分 ?EcoRI PstI (15U/?l) ?37℃, 45? 20 1 10 2 7 需量(?l) Total BamHI DNA 10? K Buffer ddH2O 成分 EcoRI PstI (H型缓冲液) 上次实验提取的重组质粒pMD18-T (Apr) ①吸样量一定要准确 ②为了不使酶污染而导致浪费,最后才加酶 ③要求在冰上操作,并充分混匀 ④开启Eppendorf管时,手不要接触到管盖内面,以防污染 ⑤样品在37℃与65℃保温时,将离心管盖严,以防水进入管内造成实验失败; 因温差的原因,管盖上有水汽,没切完毕,离心5s,确保酶切反应体积 BamHI,10?K Buffer,15 U/?l 配制1%琼脂糖凝胶(18ml),酶切样品全部点样,另取10?l未酶切质粒作对照,100V电泳,待溴酚蓝移至胶的3/4位置结束电泳; ?-Hind III digest DNA marker (50ng/?l),由于cos末端之间的结合,会影响23k和4.36k的条带,因此,电泳前热处理(60℃,5min),使Marker的电泳图像变得更为清晰北京六一仪器厂生产的?-DNA标准DNA (250ng/?l)分子量, 为HindIII酶切产物,包括7个从560bp到23,130bp的标准DNA碱基对 *