HUMSCs向男性生殖细胞方向分化的研究要点.pptx

科研故事HUMSCs向男性生殖细胞方向分化的研究Differentiation of male germ cells from human umbilical cord mesenchymal stem cells （stem cell differentiation and transplantation ） 马 廉 深圳大学妇幼保健院.深圳坪山新区妇幼保健院 Email：malian8965@ 2016/2/28 1 2016/2/28 2 干细胞在男性不育领域的研究现状Differentiation of germ cells from stem cells 2016/2/28 3 HUMSCs的生物学特性The characteristics of HUMSCs 2016/2/28 4 （1）形态学结果：采用组织贴壁法 ，原代细胞5-7天后长出，呈成纤维样贴壁生长（A、B），3-6代细胞形态规则，透光度强（C、D、F），第9代后生长状态变差，细胞变宽大，透光度较弱（E）。 （2）生长曲线结果： HUMSCs原代传代后生长速度增快，并能稳定增长。 HUMSCs生长增殖特性 2016/2/28 5 流式细胞术结果：第3代HUMSCs高表达间充质干细胞标记CD29（87.8%）、CD44（44.9%）、CD59（95%） 表达多能干细胞标记OCT4（48.6%）。 HUMSCs的表面标记 2016/2/28 6 细胞类型 免疫学特点 HUMSCs （1）表达HLA-Ⅰ； （2） 不表达CD80、CD86、CD40、CD40L、HLA-DR； （3）抑制T淋巴细胞IFN-γ的分泌； （4）能抑制经PHA激活的T淋巴细胞增殖。 HUMSCs诱导后的生殖样细胞 不能抑制T细胞的增殖 HUMSCs诱导后的胰岛样细胞 不能抑制T细胞的增殖 结论： （1）与其他组织来源的间充质细胞一样，HUMSCs具有诱导免疫耐受和免疫抑制的作用。 （2）动物实验也证实,体内输注或移植同种、MHC不匹配的MSCs (无论是供体、受体或第三者 )均有很好的耐受性，即使MSC分化为各间质谱系细胞。 HUMSCs免疫特性 2016/2/28 7 HUMSCs在向男性生殖细胞方向分化The progress in derivation of germ cells from HUMSCs 2016/2/28 8 方法：新生小鼠睾丸细胞培养液、维甲酸、睾酮作为条件诱导液，将人脐带间充质干细胞在条件诱导液中培养。 结果： 1）形态学改变：大部分HUMSCs变为圆形（图B），并出现蝌蚪样改变（图C）；扫描电镜下可见细胞变圆变大（图E），可见细胞出现蝌蚪样形态（图F）； 2）RT-PCR鉴定结果：第3、7天表达生殖细胞标记Oct4、Ckit、CD49f、Stella，第14天表达生殖细胞特异标记Vasa。 第一步：药物诱导 2015/7/2 9 3）免疫荧光鉴定结果：诱导后7、14d均能检测早期生殖细胞标记的表达：OCT4、CKIT、 VASA、CD49f、STELLA。 药物诱导 1）取得成果： 生物学特性： Human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells.Chinese Medical Journal. 2005;118 (23):1987 首次证实HUMSCs能向生殖细胞方向分化： Differentiation of human umbilical cord Wharton‘s jelly-derived mesenchymal stem cells into germ-like cells in vitro. J Cell Biochem, 2010. 109(4): 747 2）存在问题： 实验未能获得成熟的有功能的男性生殖细胞。 3）解决方案： 睾丸支持细胞对于男性生殖细胞的发生、成熟有着至关重要的作用。故我们的设想：体外分离培养睾丸支持细胞作为饲养层，模拟男性睾丸微环境诱导。（广东省课题3个） 药物诱导结果小结 2016/2/28 11 第二步：体外模拟---共培养 1d 1w 2w 3w 4w 方法： HUMSCs与睾丸支持细胞接触共培养后 结果： 1）形态学改变：逐渐形成菌落样，在28天后成圆形团簇样生长。 2）鉴定结果：诱导后， RT-PCR、免疫荧光、western-blot均显示其表达早期生殖细胞标记：stella、VASA、DAZL。 β-actin STELLA VASA