LAAT-1是溶酶体内的赖氨酸精氨酸运输体要点.docVIP

LAAT-1是溶酶体内的赖氨酸/精氨酸运输体,以此保持体内氨基酸的平衡 摘要： 从溶酶体运出分解产物的缺陷导致人类溶酶体储积病。发生于胱氨酸运输基因CTNS的突变导致胱氨酸病,但其他溶酶体氨基酸转运蛋白在分子水平上很少有区别。在这里,我们找到了秀丽隐杆线虫的赖氨酸/精氨酸运输蛋白LAAT-1。laat-1的损失造成赖氨酸和精氨酸在大量的有降解缺陷的溶酶体中的积累。在ctns-1的突变体(线虫CTNS的同系物)中,LAAT-1可以减少溶酶体胱氨酸的水平,并且可以通过半胱胺抑制溶酶体变大，半胱胺是一种通过将胱氨酸转化为赖氨酸类似物来缓解溶酶体病的药物。LAAT-1也维持可供胚胎发育期利用的胞质赖氨酸/精氨酸水平。因此,LAAT-1是溶酶体内的赖氨酸/精氨酸转运体,这暗示了半胱胺可以缓解溶酶体储积病的分子解释。 从溶酶体运出水解产物的功能缺陷引起溶酶体储积病的发生，如胱氨酸病,其特点由于溶酶体胱氨酸运输体基因CTNS(cystinosin)的突变导致自由的胱氨酸在溶酶体内的积累(1 - 4)。对胱氨酸病最有效的治疗药剂,半胱胺(一种氨基硫醇),它可以将溶酶体内自由的胱氨酸转换为半胱氨酸和混合的半胱氨酸-半胱胺的二硫化物,这被认为是通过赖氨酸/阳离子氨基酸运输体将其从溶酶体以赖氨酸类似物的形式运出的一种方式 (5 - 7)。这种运输体的分子类型仍然未知。尽管有生化检测的方法,但大多数哺乳动物的溶酶体氨基酸转运体仍然没有分子水平的表征(1)。 通过对可持续增多的胚胎细胞尸体的秀丽隐杆线虫突变体的一个正向遗传筛查,我们隔离了一个隐性突变体qx42,其内积累了许多具有折光性的尸体状物质和阳性溶酶体示踪物斑点,提示存在异常溶酶体(图S1,A到G)。使用可以标记溶酶体的NUC-1::mCherry (8、9)或溶酶体示踪染色,我们发现qx42溶酶体的体积平均是野生型秀丽隐杆线虫溶酶体体积(1.3*0.5 um3) 的两倍(图1,A到F′′′,和图S1,H 到K)。 图1.laat-1突变体积累了增大的溶酶体。(A到F′′′) 在一个laat-1(qx42)胚胎(B)或除野生型[(A)和(E)到(E′′′)]外的细胞[(F)到(F′′′)]中通过NUC-1::mCherry[(A)和(B),箭头) 或红色溶酶体示踪物(LTR)[(E)到(F′′′),箭头的头) 来显示观察增大的溶酶体。在(C)和(D)中溶酶体的体积被量化。不同种系中溶酶体的平均体积(±SEM,n = 100)如(D)所示。* * P 0.0001。(G和H)在野生型动物皮下(G)或鞘(H)细胞的荧光图像中显示有LAAT-1:: GFP和NUC-1:: mCherry的表达。在(A),(B)和(G)到(H′′)中，插图显示的是黄色箭头溶酶体放大4倍的图像。比例尺: (E)和(F)中是2微米; 其他图片中是5微米。 我们接着检查qx42突变体是否影响溶酶体的产物降解。凋亡细胞首先被吞噬,然后在溶酶体内降解。细胞死亡和细胞尸体吞食在qx42突变体中是正常的(图S2)。然而, 通过HIS-24::GFP或H2B::GFP (分别标记所有体细胞和胚芽核包括细胞尸体中的染色质)的缺失衡量在吞噬体(通过GFP::RAB-7或NUC-1::mCherry)中凋亡细胞的降解，其在qx42突变体中受到了严重影响,其中的HIS-24::GFP持续大于野生型的4倍(图2A和图S2,L到O)。通过卵黄脂蛋白的降解来滋养生长中的细胞贯穿于整个胚胎发生时期(10、11)。在qx42突变体中, 卵黄标记VIT-2::GFP的肠道分泌和卵母细胞对物质的吸收是正常的(图S3,A到B′)。然而,值得注意的是在扩大的斑点中qx42胚胎累积了更多的VIT-2::GFP,这与NUC-1::mCherry重叠,暗示溶酶体对卵黄的降解存在缺陷(图2,B到D,和图S3,C到H′)。细胞表面蛋白CAV-1和RME-2在野生型胚胎中是可以内在化和降解的, 而在qx42胚胎中则累积于增大的溶酶体中(图S4)(12)。受损的细胞器和蛋白质聚合物是通过自噬途径递送到溶酶体对其进行降解的(13)。在野生型中胚胎发育期的自噬基质SEPA-1和T12G3.1(哺乳动物p62的线虫同系物)被清除，但在qx42突变体胚胎中将持续到后期，并且与NUC-1::mCherry重叠,这显示自噬溶酶体的降解存在缺陷(图2，E到G和图S5)(14、15)。因此,qx42突变体影响了溶酶体内吞噬、内吞和自噬物质的降解。 图2.laat-1突变体在溶酶体降解各种物质方面存在缺陷。(A) 野生型和laat-1(qx42)胚胎在不同的时间点显示HIS-24::GFP和GFP::RAB-7的荧光图像。箭头指示吞噬溶酶体。右边的柱状图显示其量化的结果, 括号中显示的是平