第14章细胞因子与细胞粘附因子的测定要点.ppt

第十四章 细胞因子与细胞粘附因子的测定 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。 细胞因子 细胞粘附因子 是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。 第一节 细胞因子与细胞因子受体的 特性和功能 一 细胞因子的共同特性和作用方式 作用方式 旁分泌 自分泌 内分泌 共同特性 多效性 重叠性 拮抗性 协同性 二 细胞因子受体的共同特性 α链 专一性 β链 信号转导 三 T细胞相关细胞因子与功能 介导细胞免疫的Th1型细胞因子 IFN-γ IL-12 IL-18 IL-2 介导体液免疫的Th2型细胞因子 IL-4 IL-5 介导免疫调节和免疫抑制效应的Th3型细胞因子 TGF-β IL-10家族 介导炎症反应的Th17型细胞因子 Th17 TNF IL-23 第二节 趋化因子及趋化因子受体 了解 第三节 细胞粘附分子与受体 细胞粘附分子分类 整合素超家族 选择素超家族 免疫球蛋白超家族 钙粘素超家族 可溶性细胞粘附分子 第四节 生物学测定方法 1.基于DNA检测的分子生物学测定法： DNA扩增法 RNA印迹法 原位杂交法 核酸酶保护分析 2.生物活性测定法 生物学测定法分类 根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示 生物活性测定法原理 有助于细胞因子检测的活性作用 刺激细胞增殖或集落形成的活性维持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效应促进细胞趋化或抗病毒作用 以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。 一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法 直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法 3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法 细胞增殖检测方法分类 通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I ），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。 实验前：细胞浓度确定；台盼蓝拒染实验 结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染 (1) 放射性核素掺入法 常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件 细 胞 株 所需浓度（细胞数/ml） 3H-TdR前培养时间 3H-TdR后培养时间 检测细胞因子 D10G4.1 2×105 48 18-20 IL-1 L929 2×105 56 16 IL-1 CTLL-2 105 24 4-6 IL-2 FDC-P1,32DCL-27 5×104 24 4-8 IL-3 CT.4S 105 24 4-6 IL-4 CH12 5×103 48 6 IL-5 B13 5×104 36 12 IL-5 T88-M 1×105 24 12 IL-5 BCL1 105 72 6 IL-5 Clone-K,I×N/2bx 105 24 4-6 IL-7 TS1 3×104 66 6 IL-9 T10 105 72 6 IL-11 UT-7 1.5×105 72 6 SCF （干细胞因子） CCL-64* 5×108 72 8 TGF-β DA3.15, IF 5×104 24 4-8 GM-CSF M14/NES60.4 5×104 24 4-8 M-CSF/G-CSF 特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体（琥珀酸脱氢酶）代谢活性相关 测定步骤类似 与同位素掺入法相比 掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同 (2) MTT 比色法 四甲基偶氮唑盐比色法 细胞株/原代细胞 细胞终浓度（细胞数/ml） 加入MTT前温育时间（h） 加入后 检测细胞因子 B9，MH60,BSF2,TTD1 5×104/2×105 96/48 37度 1h IL-6 B9-11 5×104 96 I