荧光法的应用概念.pptx

荧光分析法的应用 荧光光谱法研究亚甲蓝与三种 芳香族氨基酸的相互作用 荧光分析法测定肉类食品中诺氟沙星的残留 荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的相互作用 前言： 亚甲蓝(Methylene blue，简称MB)，即3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物，是一种常见的吩噻嗪类药物，其与蛋白质具有很好的亲和力，可以改变药物在生物体内的分配和代谢。其可用作癌症光化学治疗剂、起到协同抗肿瘤作用，以及肿瘤染色标记等；另外，亚甲蓝对细胞具有明显的解毒功效，在镇痛、抗菌、抗病毒等方面也有明确的治疗作用。因此研究亚甲蓝的药理作用是十分有意义的工作。 色氨酸(Tryptophan，简称Trp)、酪氨酸(Tyrosine，简称Tyr)及苯丙氨酸(Phenylalanine，简称Phe)是三种芳香族氨基酸，是构成蛋白质和多肽的主要物质，是生物体中不可缺少的营养成分之一。这三种氨基酸具有荧光，也是蛋白质天然荧光的主要来源，其具有广泛的用途。 开展药物与氨基酸的相互作用研究，有助于深入了解药物作用机制及在体内运输、代谢过程，而且对于新型药物的设计具有重要的指导作用。 溶液配制： 配制浓度为2×10-4mol/L 的MB储备液；Trp、Tyr和Phe储备液的浓度分别为2×10-4mol/L、2×10-4mol/L 和2×10-3mol/L (2×10-3mol/L、2×10-3mol/L 和2×10-2mol/L )；配制0.02mol/L 的pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液(含0.1mol/L 的NaCl以恒定的溶液离子强度)。光谱测定所需溶液均使用缓冲溶液稀释、定容。 荧光光谱测定： 分别恒定温度在298.15K和310.15K条件下，按实验需要，准确移取一定量的MB和各氨基酸标准溶液于10mL容量瓶，用pH7.4的Tris-HCI缓冲溶液定容，水浴恒温振荡1h，然后冷却至室温，置于1cm的石英比色皿中，设置荧光光谱仪的激发和发射光栅狭缝均为5nm，光电倍增管电压为700mV，扫描速度为300nm·min-1，在此条件下记录280nm～550nm范围内的荧光光谱。 结果与讨论 一、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的荧光猝灭光谱 分别固定Trp、Tyr和Phe浓度，依次递增MB浓度，设置Trp、Tyr和Phe激发波长为277nm、273nm和260nm，在相同实验条件下，分别测定298.15K和310.15K时MB与Trp、MB与Tyr以及MB与Phe相互作用荧光光谱。 由图可见，Trp、Tyr和Phe的最大荧光发射波长分别为346、303nm和282nm，随着MB浓度递增，Trp、Tyr和Phe荧光强度均逐渐降低，荧光光谱峰形保持不变，MB-Trp最大吸收位置红移约3nm，MB-Tyr红移约5nm，MB-Phe荧光峰蓝移约3nm。以上实验结果说明MB与Trp、MB与Tyr以及MB与Phe发生相互作用导致Trp、Tyr和Phe发生了荧光猝灭现象。 插图为荧光猝灭值(F0-F)对cMB(2×10-6～2.3×10-5mol/L )的线性拟合曲线，其中F0和F分别表示不加入和加入MB的荧光强度。相应回归方程的相关系数均在0.99以上，呈现很好的线性相关性，表明该法可用于痕量MB的测定。 二、亚甲蓝对三种芳香族氨基酸的荧光猝灭机理 荧光猝灭是溶液中猝灭体分子和荧光物质分子之间发生相互作用，使荧光物质的荧光量子效率降低或激发态寿命缩短，从而导致荧光强度降低的现象。荧光强度降低分为：动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是指猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间所发生的与扩散有关的相互作用过程；静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物，从而导致荧光强度降低的过程。 MB对三种氨基酸发生的荧光猝灭，其应遵循Stem-Volmer方程： F0/F-1=Ksvc=Kqτ0c (1) 式中，F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂的荧光强度；c为猝灭剂浓度，Ksv为动态Stern-Volmer猝灭常数，Kq是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数，τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命。 根据式(1)绘制三种氨基酸分别在298.15K和310.15K下的( F0/F-1)～C的线性拟合曲线(如图4所示)。 结果显示，MB-Trp、MB-Tyr和MB-Phe作用过程中，随着温度升高Ksv减小，说明升高温度可能降低了复合物的稳定性，从而使猝灭常数下降。由此推断MB对Trp、Tyr和Phe均为静态猝灭作用。 Trp、Tyr和Phe的荧光寿命分别为3.1×10-9s、3.6×10-9s和6.8×10-9s。根据式(1)