第二章电镜酶细胞化学技术与电镜免疫细胞化学技术要点.ppt

第二章 电镜酶细胞化学技术与电镜免疫细胞化学技术 医学院电镜室 2012年5月5日 概述 电镜细胞化学技术 电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。 目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。 电镜细胞化学技术主要包括： 电镜酶细胞化学技术 电镜免疫细胞化学技术 特异酶消化印证技术 电镜放射自显影技术 电镜原位杂交技术 超微示踪技术等 第一节 电镜酶细胞化学技术 ★ 目的： 在超微形态保存良好的组织上，在酶存在的部位显示酶活性。侧重于显示细胞器的标志酶及其动态变化。 目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶 ★ 电镜酶细胞化学与光镜酶组织化学的比较： 光镜酶组织化学 电镜酶细胞化学 分辨率低 分辨率高 难于鉴别细胞器和酶的精确位置 易于鉴别和定位 反应产物为有色沉淀 反应产物必需有高电子密度 可显示100多种酶 可显示40余种酶 ★电镜酶细胞化学的基本原理 酶细胞化学反应 酶+底物 初级反应产物 最终反应产物 ?  （可溶性） （不溶性） 酶反应 捕捉反应 捕捉剂 常用捕捉剂有：重金属（铅、钡、铜）盐、重氮盐、二氨基联苯胺等。 捕捉反应的思路是形成在显微镜下可见的最终反应产物，即最终产物一定是光镜下具有鲜明颜色的物质，在电镜下则必须是高电子密度的物质 。 ★ 电镜酶细胞化学反应的主要方法 ⑴金属盐沉淀法 将重金属作为捕捉剂，使酶反应产物直接或间接与之结合生成金属盐沉淀 。 ① 酶作用于底物，初级产物与捕捉剂形成金属盐沉淀。 R-PO4+H2O 磷酸酶 R·OH+H3PO4 Pb2+ PbHPO4↓ ② 酶作用于底物，底物之一为生理底物，在反应中被氧化，底物之二为捕捉底物，在反应中被还原，被还原的捕捉底物与加入的重金属捕捉剂形成金属盐沉淀。 琥珀酸脱氢酶 琥珀酸盐 铁氰化物 延胡索酸盐 亚铁氰化物 Cu2+ 亚铁氰化铜（高电子密度） （2）非金属有机化合物沉淀法 常用底物为α-醋酸萘酚、萘酚AS-β-葡萄糖苷酸、 β-萘酚磷酸钙等萘酚系列衍生物。 用于显示糖苷酶、磷酸酶、酯酶等。 初级产物：萘酚 萘酚+捕捉剂重氮盐 偶氮色素 （3）锇化法 嗜锇物质生成法 在酶作用下，生成“嗜锇”性捕捉底物，经锇酸作用后形成高电子密度的锇黑 过氧化物酶 ? H2O2 nDAB（四盐酸二氨基联苯胺） H2O DAB氧化原合物 锇酸 锇黑（高电子密度） ★电镜酶细胞化学的常规操作流程 酶细胞化学技术包括三个基本过程：①酶的固定，使酶固定在组织细胞所在部位，防止移位；②酶的特异性反应；③使反应产物在显微镜下可见。第一过程在样品制备中完成，后两个过程包含在孵育反应中。 取材（3×8mm）→ 固定（酶固定+结构固定）→ 切组织片（40-60um）→ 孵育（酶反应+捕捉反应）→ 脱水、包埋 → 超薄切片 → 电镜观察 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定液