人类基因组学课件第二讲.pptVIP

基因芯片的制备 点样法 原位合成法AFFY 光纤微珠Illumina 点样法 基片制备 点样 玻片——基片——芯片 基片+DNA: 基因芯片的二大组成要素 合成后点样 按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。 接触式和非接触式 cDNA PCR 产物 Oligo 基因芯片点样法制备过程展示 点样法 光刻原位合成法Affymetrix芯片介绍 原位合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。 光刻原位合成法是将光平版印刷技术(photolithographic approach)运用到DNA合成化学中，利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样性的化合物集合。 GeneChip以边长12.7cm(5英寸)的正方形石英片为材料进行生产。 石英片是天然羟基化的基质，表面均匀的羟基化具有结合其它化合物的良好特性。 Affymetrix芯片介绍 硅烷化石英片：硅烷膜为探针合成提供了密度均匀的羟基；附着在硅烷膜上的连接分子则提供了可以在空间上被光激活的表面。 硅烷分子间的距离决定了探针的固定密度，可以在边长1.28cm正方形的面积上固定大于500,000个探针位点(feature)，每一个位点上容纳了数百万个相同的DNA分子。 当合成过程全部完成之后，石英片去除保护基团，切割成小块，每一块即为一张芯片。 每张芯片被装在一个塑料舱中，便于贮存和操作，同时也提供了在扫描仪中精确、重复定位芯片的装置。样品室深1mm，可以容纳200μL杂交液体。 The GeneChip? Substrate Depending on the final size of the chip, they can manufacture 49 chips per wafer or 400 chips per wafer – the smaller the chip size, the more they can produce from each wafer（晶片） Synthesis of Ordered Oligonucleotide Arrays 合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 接下来的合成步骤里，别的掩膜被加在石英片表面，发生新的一轮去保护和核苷酸偶联。这些步骤不断重复直至合成全长的探针，通常是25个核苷酸。 虽然合成过程效率是非常高的，但是仍然有少数活化的分子未能和新的核苷酸发生偶联。为了避免这些漏掉一个核苷酸的DNA分子成为探针，用一步加帽步骤截断它们。 Process of Synthesis Completed Array The image represents the completed array In actuality, each probe would be 25 base pairs long The amount of steps (or rounds of the two steps) that occurs to build a chip varies, but is usually around one hundred Affymetrix 原位合成 优点 序列可精确控制 生产快速 高密度（可达40万点/1.6平方厘米） 共价交联固定 缺点 设备昂贵 片段短（25mer)，适合再测序 合成过程中大量不完全片断残留在基片上 设计工作量大（合成大量蔽光膜），芯片更新慢 探针问题 光导原位合成法需要预选设计、制造一系列蔽光掩膜，造价较高；制造过程中采用光脱保护方式，掩膜孔径较小时会发生光衍射现象，制约了探针密度的进一步提高，而且光脱保护不彻底，每步产率只有92-94%，因此这种方法只能合成30nt左右的寡核苷酸探针，同时探针区域由于存在大量不成功的合成片段，造成杂交背景较高，不适于定量检测。 更新慢，而旧的数据库中有的序列有错误 其他原位合成芯片类型 压电打印原位合成 装置：类似彩色喷墨打印机 技术：常规的固相合成方法，即将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代。 合成原理：传统的核酸固相合成技术。通过用机械手臂直接将碱基合成试剂氨基磷酸脂点样到芯片适当的位置上，循环下去就能合成预计的寡核苷酸。 优点：灵活性高，能合成任意寡核苷酸片段 应用的公司：美国Agilent 公司