第四章植物基因工程基本技术-核酸分离要点.ppt

第四章 植物基因工程基本技术-核酸提取及分离 第四章 植物基因工程基本技术-核酸提取及分离 第一节 核酸提取技术 第一节 核酸电泳技术 第一节 核酸提取技术 Part One Techniques of Nucleic Acid Isolation 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 内容 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 　　　核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 前言 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 第一部分：DNA提取方法简介 第一部分：DNA提取方法简介 Break down the cell wall and membranes Centrifuge to separate the solids from the dissolved DNA Precipitate the DNA using isopropanol Centrifuge to separate the DNA from the dissolved salts and sugars Wash the DNA pellet with Ethanol and dry the pellet Dissolve DNA Overview of DNA Extraction DNA 提取 的基 本步 骤 DNA提取的几种方法 　基因组DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　其它 DNA提取的几种方法 　非基因组DNA的提取 　质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法　 　线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 　CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB PVP40 β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（V/V）使用前加入 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 基因组DNA－ CTAB法 Disruption of cell walls by grinding Lysis of cells in extraction buffer Step 1+2: mechanical disruption and homogenization in extraction buffer Extraction/Precipitation Method Grind sample into a fine powder to shear cell walls and membranes Mix thoroughly with extraction buffer to dissolve cell membranes and inhibit nuclease act