25-现代分子生物学-土壤微生物基因表达的-胡忠精编.ppt

2009.3.10 了解微生物的功能 了解微生物与环境的关系 有益微生物 有用的基因 环境指标 对微生物种类定性 对微生物功能定性 对特定的基因定性和定量研究 微生物或微生物基因的表达如何受环境调控？ 收集 培养 筛选 鉴定 克隆特定基因（同源序列，表达文库，消减杂交等方法） 99%的土壤微生物是不可培养的 培养中的土壤微生物功能不完善 某些在极端环境生活的微生物 原位研究方法 以提取土壤DNA和RNA为基础，结合一系列研究方法 优点： 无需培养，直接反映环境中微生物的状态； 所研究是微生物同环境直接的关系 缺点： 从土壤样品提取DNA和RNA的效率 不同处理方法的效果 DNA芯片 实时定量-PCR 稳定同位素探针 报告基因 基因芯片是将大量靶基因（或基因片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片上等载体上，形成矩阵。将待侧样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用激光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似与传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的。 1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。 1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期 高通量 微型化 自动化 低成本 高度并行 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 荧光染料嵌合法 探针法 氯化铯密度梯度离心 可以检测不同环境下基因的表达 通过融合表达，可以对特定基因进行定量分析 绿色荧光蛋白（GFP）,发现于水母（Aequorea victoria）和海肾（Renilla reniformis） GFP在原核和真核生物中都能表达，不需要底物和协同因子，很容易被检测，即使单个细胞，具有很好的稳定性 GFP 16S rRNA鉴定微生物 功能基因的克隆 各种方法和技术 培养方法：形态、生理生化指标等，16S rRNA技术 原位方法： 16S rRNA结合DNA芯片技术 16S rRNA是原核生物的一种核糖体RNA 其在生物进化过程中，序列变化非常缓慢，可用来标记生物进化距离和亲缘关系。 分析的一般方法是从微生物样本中提取16S rRNA基因片段，通过测序获得序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定微生物种类 目前，GEN-BANK已经涵盖了不下10万种原核生物的16S rRNA基因序列信息 培养方法：抗逆，特殊氮源、碳源的利用，毒性等 原位方法：特定基因的表达研究 功能基因的定性：基因芯片，同源序列克隆，环境基因组计划，差异显示技术，分子信标 功能基因的定量：Northern，原位杂交，RNase保护实验，RT-PCR 营养状况 同污染物的分解相关的基因 含氧状态 土壤pH 土壤温度和湿度 碳源 氮源 磷源 微生物的固氮作用 相关基因的表达及调控 大量的微生物可以利用土壤环境中非自然的污染物。研究土壤环境中的生物回收技术是可行的，但是，成功的回收有赖于稳定而强大的微生物活力。大量的环境因子会影响与生物回收相关的微生物的活力。一些研究者已经开始应用功能基因作用于环境污染物的降解。 ? Holden等鉴定了受十六烷污染的沙中表达的表面活性组分基因。将gfp融合在pra和rhlR的启动子后边，其中pra编码的PA蛋白起乳化作用。使用灭菌的石英砂作为培养基质。当16烷是唯一碳源时，细菌最初的C:N是12。gfp表达表明pra和rhlR都被诱导了。然而，即使这些编码表面活性组分的基因转录被激活了，细菌降解十六烷的能力仍未提高。 启动子陷阱 氧是土壤中另一环境因子，土壤微生物必需适应环境中氧浓度的不断变化。 在缺氧条件下，一些特定的蛋白获得了大量的表达。 然而，对于土壤环境中氧对基因表达的调节还缺乏直接的数据。 用lux同参与萘降解途径的基因融合 在对土壤的生物发光量直接探测时，使用了一种便携式照片扩增管，使用时只需将小管插插