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第六章 微生物的生长及其控制 微生物生长：可分为个体生长与群体生长，个体生长是单个细胞的成分不可逆和按比例的增加，群体生长为单位时间内细胞数量或细胞质量的增加。 微生物繁殖：微生物个体数量的增加即为繁殖。 微生物学中提到的生长，一般均指群体生长。 第一节 测定生长繁殖的方法 1 测生长量 1.1直接法 测体积法：用刻度离心管离心培养物，测微生物体积。 测干重法：将单位体积的液体培养基中培养的微生物，经过滤或离心收集菌体细胞，用水洗净附在细胞表面的残留培养基。在105℃高温或真空下干燥至恒重，称重，即为微生物细胞干重。 1.2 间接法 微生物悬液中细胞的数量越多，浊度越大，在一定浓度范围内，悬液中的细菌细胞浓度与光密度(OD值）成正比，同透光度成反比。 预先测定光密度与细菌数目的关系曲线，然后根据此曲线查得待测样品细菌数。用分光光度法测定，一般选用450－650nm波段。注意事项：菌悬液细胞浓度不宜过高或过低；培养液的颜色不宜过深，因为颗粒性杂质也会干扰测定结果。 1.2.1 比浊法 分光光度法 麦氏比浊法 取质量大小一致的试管10支，分别加入1％纯氯化钡液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，再于各管中添加1％纯硫酸液，使各管中液体的总量均为10mL，即生成不同量的硫酸钡，用火焰将管口封闭或用胶赛赛紧，并在管上标出1、2、3－10字样，即为麦氏比浊管。 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1％氯化钡 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1％硫酸液 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 菌数（亿/毫升） 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 18.0 21.0 24.0 27.0 30.0 麦氏比浊管的配制及相当的菌数 1.2.2生理指标法 微生物的许多生理指标与其生长量相平行，可根据实验目的和条件适当选用。如测含氮量、含碳量、磷。DNA、RNA、几丁质等均可用于生长量的测定。 4.生理指标法 测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。 2 计 繁 殖 数 2.1 显微镜直接计数法 用计数板在显微镜下直接观察并计数细菌细胞。用特殊染料作活菌染色，可区分活、死细胞。 用美兰对酵母菌染色，活细胞为无色，死细胞为蓝色。 细菌经吖啶橙染色，在紫外光显微镜下，活细胞发出橙色荧光，死细胞为绿色荧光。 2.2 间接法 平板菌落计数法：根据营养琼脂平板上的“菌落形成单位”（CFU）进行计数。可用浇注平板或涂布平板等方法进行。 厌氧菌的菌落计数法：亨盖特滚管培养法、半固体深层琼脂法。 第二节 微生物的生长规律 同步生长：创造条件使群体细胞中每个个体细胞在生活周期中都处于相同的生长阶段，即细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长。同步生长的群体一般只能维持2－3代，随时间延长，逐渐转入非同步生长。 1 微生物的个体生长和同步生长 获得微生物同步生长的方法： 诱导法：通过改变营养、温度等环境条件，诱使不同步的培养物实现同步化。氯霉素抑制细菌的蛋白合成、细菌芽孢诱导发芽等。 机械分离法：处于同一生长阶段的细胞，其体积、大小是相同的，所以可用过滤法、区带离心法和膜洗脱法收集同步生长的细胞。其中膜洗脱法较为常用。 生长曲线： 定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。 2 单细胞微生物的典型生长曲线 延滞期 指数期 ?稳定期 衰亡期 生长速率常数：微生物细胞每小时的分裂次数（R）。 延滞期 影响延滞期长短的因素： ◆ 接种龄（对数期、延滞期、衰亡期） ◆ 接种量 ◆ 培养基成分 ◆ 种子损伤度 ◆ 遗传特性 出现延滞期的原因： ◆ 缺乏分解或催化底物的酶或辅酶 ◆ 缺乏合成有关的中间代谢产物 指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时期。 指 数 期 ● 生长速率常数R最大，代时 和倍增时间最短。 ● 细胞进行平衡生长 ● 酶系活跃，代谢旺盛 ● 细胞大小比较一致，生活力强 影响指数期长短的因素： ◆ 菌种 ◆ 营养成分 ◆ 营养物浓度（生长限制因子） ◆ 培养温度 细菌经过延滞期进入指数期，即以最大速率生长和分裂，细胞数量呈对数