分子生物学补充要点.doc

基因工程是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。 第一部分 基因表达 基因工程的主要内容或步骤 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。（切） 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能自我复制的并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。（连） 3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起繁殖。（转、筛） 4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。（扩） 5、从这些筛选出的受体细胞克隆，提取出已经得到扩散的目的基因，供进一步分析研究使用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产出人类所需要的物质。 外源基因在原核细胞中的表达 外源基因在真核细胞中的表达 常用载体： 1. Prokaryotic expression vector 原核表达载体 2. Baculovirus expression vector 昆虫杆状病毒表达载体 3. Mammalian expression vector 哺乳动物表达载体 4. Yeast expression vector 酵母表达载体 5. Adenoviral and retroviral vector 腺病毒及逆转录病毒表达载体 外源基因具备的条件：1.编码区不含插入序列；（mRNA-cDNA）2.位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；3.含起始密码子、终止密码子；4.转录出的mRNA必须有SD序列，调整SD序列与第一个AUG间的距离（因为会对转译效率有影响）；5.产物比较稳定（如：融合蛋白、信号肽）；6.选择系统偏好的简并密码。 影响外源基因表达的因素： 1.启动子的强弱（主要因素） 2.基因的剂量3.RNA转译效率（SD互补、AUG-SD距离及序列、AUG前后核苷酸序列的适宜性）4.密码子5.表达产物的大小6.产物的稳定性 受体细胞的选择 不同类型的细胞具有不同的特征，对要表达的外源基因具有不同的适应性。 如：CHO细胞、CV-1或NIH-3T3 选择标记 特定细胞、选择标记、选择性培养基——特定的选择系统。 常用的：胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因、新霉素磷酸转 移酶基因选择系统等。 导入细胞： ?转化（transformation):指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入原核生物里面的过程。 ?转染(transfection):指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 ?转导(transduction):转导是指通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。（狭义：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。） 导入细胞的方法： 重组体导入细胞的方法 哺乳动物细胞 （磷酸钙沉淀 显微注射 脂质体 DEAE-dextran ） 酵母菌——电转 大肠杆菌—— CaCl2法制备感受态细胞，热攻击法转化 重组蛋白的诱导表达及检测：1.IPTG诱导2.温度诱导3.检测:SDS电泳 第二部分 蛋白质的纯化 蛋白质的分离纯化的一般原则 一、原料的选择：富集于哪种组织、细胞；胞外or胞内表达。组织和细胞的破碎方法：匀浆、电动捣碎、超声破碎、反复动融。细菌、酵母、哺乳动物细胞 二、粗分：简单、易处理、快速。如利用蛋白质溶解度不同，在不同pH值下，不同饱和度的硫酸铵沉淀；有机溶剂分级沉淀；分级离心等。 三、精制备 ：离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲核层析、电泳、离心、结晶以及一些免疫的方法。 注意保持生物活性，如pH值、温度、加入酶的抑制剂、金属离子络合剂（EDTA）等。 蛋白质的分离纯化技术 ： 1.溶解度差别2.分子大小不同3.蛋白质分子带电性质不同4.蛋白质吸附性质不同5.蛋白质的特异性配体 原理应用 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL)的表达、纯化和抗肿瘤活性研究 技术路线 引物设计 表达载体 ： TRAIL全基因及可溶型sTRAIL基因PCR扩增 提取正常人外周血淋巴细胞总RNA TRAIL全基因的获得 以该总RNA为模板，用宝生物公司的BeaBEST 反转录试剂盒进行反转录。以该反转录产物为模板，加入引物P1，P2进行第一次PCR。 sTRAIL基因的获得 以TRAIL全基因经纯化的PCR产物为模板，加入引物P1’，P2，再次PCR sTRAIL基因，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。 含肠激酶位点的pThioHisA-sTRAIL表达载体的构建 纯化后的TRAIL、sTRA