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Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme 第三章 酶的分离纯化 Contents of chapter 3 3.1、酶的提取与分离纯化技术路线 3.2、生物原始材料的制备与细胞破碎 3.3、酶的提取与酶溶液的净化、脱色 3.4、酶的分离方法 Go Go Go Go 3.5、酶的组合分离纯化策略 Go 3.6、酶的浓缩、干燥与结晶 Go 细胞结构与酶分布 分离纯化方法的设计考虑的因素 原料、背景知识的了解； 操作温和、环境； 溶液中各个参数及使用的辅助试剂； 灵敏、特异的检测手段； 纯化手段的选择。 酶分离纯化的特点 酶在生物细胞中的含量很低，分离纯化很难； 通过测定活力的方法可以跟踪酶，能迅 速找出分离纯化过程的关键； 酶活性测定 酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。 酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。 酶反应速度(指初速度)可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。其单位为mol/s。 比活力 比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示。一 般来说，酶的比活力越高，酶越纯。 酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。 酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。 （1）酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应: (2)化学法 化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性。 （3）放射性化学法 是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性。 （4）一般的连续法 包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 （5）偶联的连续法 是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必须在酶反应相同条件（pH、温度等）下进行，且加入的指示酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。 具体应用的实例 Novo Nordisk（诺维信公司）采用平皿法 ： 二甲基酪蛋白和明胶 蛋白质水解样品 测定D大小 标准品D大小 四个阶段 预处理（pretreatment） 粗分级分离（rough fractionation） 细分级分离（fine fractionation） 成品加工（concentration and desiccation） A 纯化阶段 B分析方法 Material Extraction Protein fractionation Ammonium sulfate Chromatography Gel filtration/Ion exchange Affinity chromatography/HPLC Electrophoresis Pure enzyme Background knowledge about material Protein/ activity analysis Electrophoresis: Native/ SDS/ Gradient PAGE Kinetic study Molecular weight/ Sedimentation coefficient Quaternary structure/ Isoelectric focusing Peptide mapping Amino acid analysis Amino acid sequencing Extinction coefficient Antibody production Immunoassays: ELISA/ Immunoblotting immunoelectrophoresis crysta