9转化BL21_2011年分子生物学实验.ppt

* 大肠杆菌BL21感受态细胞制备及重组DNA的转化 实 验 八 背景理论知识 Section 1 8.1.1 实 验 目 的 掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法 掌握质粒转化的方法技术 受体菌: (一般不带特异的筛选标记） E.Coli BL21（DE3）(用T7启动子进行原核表达) DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，其基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5 重组质粒: （Kanr） pET28a-eGFP 8.1.2 受体菌与重组质粒 8.1.3质粒DNA的转化 + 质粒DNA 420C热击 370C复苏 Kan+筛选 感受态细胞 Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 8.1.4 影响转化效率的因素 细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态 OD值：0.3－0.5 (5X107个/ml) 试剂的质量： 化合物及无机离子：Rb+、Mn+、二甲亚砜等 质粒：大小、构型 外源DNA（质粒）与细胞的比例： 器皿的洁净度 污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行 实验操作 Section 2 8.2.1 实验器材 摇床 分光光度计 冷冻离心机 超净工作台 恒温水浴 涂布棒 恒温培养箱 LB液体培养基 LB固体培养基 卡那霉素（Kan） 0.1 M CaCl2 30% 甘油 8.2.2 实验试剂 1、接单菌落到5ml LB液体培养基中，37℃、190rpm振荡培养过夜。 2、1%（50 μl) 菌液接种到含5 ml LB的试管中，37℃ 振荡培养1-2小时，至OD600 0.4-0.5。（已完成） 3、将1.5mL菌液转移到离心管中。 4、离心 5000rpm，3min。 5、倒出培养液上清。 6、用冰预冷的1ml 0.1M的CaCl2处理、轻轻悬浮细胞。 7、冰上静置20min。 8、5000rpm，4℃离心5min，倒出上清。 9、100μl CaCl2轻轻悬浮，冰浴待用。 8.2.3 大肠杆菌BL21感受态的制备 实验流程图 8.2.4 质粒的转化 100μl的感受态细胞分成2管(50μl/EP管) 实验样品: 将2μl重组质粒DNA加入到50μl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P+） 阴性对照：将2μl无菌水加入到50μl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P-） 冰浴10min （热击）42℃，90sec，静置，勿摇动 迅速放到冰上,冰浴2min （复苏）加入950μl LB液体培养基（无抗性），标明组号，37℃，150rpm摇床培养15min 每两人一组做重组DNA的转化： 每50μL感受态细胞悬液中加入2μL重组DNA,轻轻摇匀，同时设置一组对照，具体操作按下表进行： 50 Kan —— 2 重组DNA 学生N2 4 50 无 2 —— 阴性对照 学生N2 3 学生N1 学生N1 组内分工 50 Kan —— 2 重组DNA 2 50 Kan 2 —— 阴性对照 1 受体菌/ μl 平皿抗性 灭菌水μl 重组DNA/μl 组 别 编号 每组（两人）在转化菌复苏时制备三块Kan LB琼脂平板,一块无抗性平板，并作好标记。 *