分子实验——影响PR扩增因素的分析.docVIP

影响PCR扩增因素的分析 【摘要】聚合酶链反应(PCR)技术问世以来，已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断完善，不仅广泛应用在基础研究领域，在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。该反应具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点 【关键词】聚合酶链式反应(PCR) 温度 引物 Taq DNA聚合酶 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验发现，DNA在高温时发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其最基本的3个环节是:①DNA变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。 ②退火（复性）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。 ③延伸：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。由以上三个环节组成一个周期，循环进行，每一循环，DNA含量增加一倍，此方法操作简便快速，并且非常有效，可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。 它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。目前为止，PCR技术已有十几种之多，如将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 1.引物要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。设计引物应遵循以下原则：引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72）下不会形成稳定的杂合体。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G+C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳+C太少扩增效果不佳，G+C过易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，引物之间两个引物之间不应发生互补特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。酶及其浓度早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶纯品。DNA聚合酶是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一个片段分子量为34000，具有5’→’3’外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。二是有’