3槟榔花中酚类物质对紫外损伤HSF细胞的保护作用课程.docVIP

3 槟榔花中酚类物质对紫外损伤HSF细胞的保护作用 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 表儿茶素、没食子酸、芦丁和香豆酸，美国sigma公司；人皮肤成纤维细胞HSF，中国科学院细胞库提供；MTT、二甲基亚枫DMSO)，美国Sigma公司；DMEM培养基、胰酶Trypsin)，美国Gibco公司；胎牛血清FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司；美国Gibco公司其他均为AR级试剂。 1.2 主要仪器 荧光测读仪Thermo scientific varioskan ascent FL)；CO2培养箱WJ-185I)；倒置显微镜leica)；离心机TDZ4-WS)； 超净工作台ZHJH-1109B)等。 1.3 实验方法 紫外损伤模型的建立 HSF细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件为 5%CO2，温度37℃，饱和湿度。当细胞处于对数生长期时，用0.25%胰酶消化后用吸管吹打成单细胞悬液，以2×105个/mL的密度接种于35mm细胞培养皿中，过夜培养。 实验分为正常对照组、紫外照射组照射时间分别为1h，2h，3h。首先吸除各细胞培养皿中的培养液，PBS冲洗一次后加入700μLPBS覆盖底面避免干燥，紫外照射组放入20W短波紫外灯下照，照射距离为20cm，正常对照组不经过紫外照射。紫外照射结束后，采用MTT法测定各组细胞存活率。 酚类物质对HSF细胞紫外损伤的保护作用 实验分为正常对照组、紫外照射组、酚类保护组。实验分组后，吸除各细胞培养皿中的培养液，PBS冲洗一次后加入700μLPBS覆盖底面避免干燥，紫外照射组和酚类保护组放入20W短波紫外灯下照射3.5h，照射距离为20cm，正常对照组不经过紫外照射。紫外照射结束后，采用MTT法测定各组细胞存活率。采用的酚类物质包括：表儿茶素，没食子酸，香豆酸、芦丁。根据预试验结果，表儿茶素的作用浓度确定为1、2.5 μg/mL，没食子酸作用浓度1、5ug/ml,香豆酸的作用浓度为1、10 μg/mL，芦丁的作用浓度1、10ug/ml。 线粒体膜肿胀度检测 收集分组处理后的细胞，8000 rpm离心5 min，放入冰箱中反复冻融三次。考马斯亮蓝染色法测定线粒体蛋白浓度，取50 μg蛋白加入到总体积为200 μL的反应缓冲液中（250 mmol/L蔗糖、5 mmol/L KH2P04、3 mmol/L琥珀酸钠，pH 7.2），混匀后记录520 nm处吸光度值，测定过程保持25 ℃恒温[21-22]。 线粒体标志性酶LDH和CS活性测定[28-29] ①乳酸脱氢酶（LDH）的活性测定 开启预热分光光度计，取435ul缓冲液（80mM Tris、200Mm NaCl ,pH7.5）,加入50ul 0.20Mm NADH,以及收集分组处理后的细胞10ul，再加入5ul丙酮酸，迅速混匀，并快速置入分光光度计中，在A340nm处每隔30s记录一个数值，连续记录10min。 ②柠檬酸合酶（CS）的活性测定 开启预热分光光度计，将波长设置为412nm,在1ml比色杯中加入435ul缓冲液(100mMTris-HCl ,PH8.0),加入20ul 5mM DTNB、5uL Triton、20ul乙酰辅酶A，以及10ul收集分组处理后的细胞，混匀后置于分光光度计中。以此为本底，调零，然后再在比色杯中加入10ul草酰乙酸，抽吸混匀，每隔10s记录一个数据，共记录2分钟。线粒体超氧自由基的测定 用Isolation Buffer B稀释线粒体蛋白至的浓度，混匀。加样步骤（“-”为缓冲液补足）： 对照1 对照2 处理后的细胞液 缓冲液（150ul) + + + 线粒体蛋白（25ul） - + NBT (25ul) - + + 将其放在振摇床上15-60分钟，然后在A570nm处测吸光度，每隔15分测一次。 2 结果与分析 2.1 紫外线对细胞的紫外损伤作用 紫外辐射是电磁波谱中介于电离辐射和可见光辐射之间的部分，其波长介于100-400nm之间。它对细胞有一定的杀伤作用，尤其会引起DNA 损伤，还可引起细胞DNA断裂和DNA-蛋白质交联以及染色体畸变[30]。为了建立紫外线对HSF细胞的氧化损伤模型，采用不同照射时间（终时间为0h、1h、2h、3h）处理HSF细胞，细胞存活率的结果见图3。随着照射时间增长，细胞存活率逐渐减低，且呈时间依赖性。紫外照射细胞2h后，HSF细胞死亡率达到（65.02±0.56）%，故选择此照射时长建立模型。 图3 不同紫外照射时长对HSF细胞存活率的影响 2.2 酚类物质对紫外损伤的HSF细胞的保护作用 在槟榔花中4种主要酚类物质（表儿茶素、没食子酸、香豆酸、芦丁）的保护下，HSF细胞在紫外损伤