8.7印迹法课程.pptVIP

（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质利用某种动力（毛细作用、扩散作用、电动力），有凝胶转移到固相膜上，然后利用探针，即特异性抗体进行检测。 1 原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 抗原 一抗 二抗 标记 1）硝酸纤维素膜（NC膜） 与蛋白质可能是通过疏水作用非共价结合。使用时不需要活化，在p H8.0时，蛋白质比较容易吸附于膜上。 问题是小分子量的蛋白质与NC膜的结合力较差。 2、固相膜种类 2）重氮化纤维素膜 有DBM和DPT两种，使用前必须活化才能使蛋白质分子共价地结合在膜上。 优点：能确保低分子量的蛋白质与膜结合，并可以一次印迹后，先后用多种探针分别检测。 缺点：比较粗糙，印迹效果没有NC膜好，接合量也小于NC膜。由于活化后呈黄色，不适于酶法检测。 3）阳离子化尼龙膜（Zeta－探针膜） 该膜对蛋白质有很高的结合力，可用来检测目的蛋白含量很微的样品，也可已经多次杂交，缺点是对封闭物浓度的要求较高。 4）DEAE 该膜适于进行快速的酶分析，但用缓冲液浸泡后易碎，很少采用。 1）毛细管印迹法 毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。 但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。 3 印迹方法 2）电转移法 这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。 两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。  电转印迹 — + 4、探针 转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。 1）一抗 针对目的蛋白的抗体。 一抗探针的质量是影响杂交效果的主要因素之一，只有特异性强、效价高的抗体，目的蛋白的检出才能得到一定的灵敏度。 一抗可使用由目的蛋白制成的抗血清或单克隆抗体。 2）二抗 与一抗结合的抗体。 二抗带有特定标记，标记物有放射性及非放射性两种。 放射性标记主要使用125I、32P等；非放射标记主要是酶，酶标记中最常用的是过氧化物酶及碱性磷酸酶。 蛋白质混合样本经过SDS电泳后，分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗血清或单克隆抗体相应的待检测蛋白质（抗原蛋白）。 将NC膜与抗血清一起孵育，使抗血清（一抗）与特异蛋白条带结合，再与经过荧光素、酶或同位素标记的二抗反应，即可检测出样品中待检抗原及其含量。 5、实验流程 蛋白质样品（抗原）的制备 转膜 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE） 加一抗与抗原结合 显色反应 加二抗与一抗的结合 Western bloting是用来对蛋白质进行检测的一种常用方法，通过抗原抗体的免疫反应可以定量测出抗体的相对分子量，以及抗体的相对丰度或与已知抗原的关系等等。目前它应用在多个领域,在临床上检测传染病和自身免疫病、过敏症等，在抗体生产领域它与ELISA、ICC、IHC、IFA等免疫技术相接合已成为单克隆抗体生产的主要筛选手段。 三种印迹技术的比较 一、概述 §印迹法（blotting）：将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术（blotting）。 §Southern在1975年首先提出了分子印迹的概念。 8.6 印迹法 二、类型 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术