2015-树达酶切与电泳课程.ppt

实验二 限制性酶切质粒DNA 与琼脂糖凝胶电泳鉴定 一. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。 二. 实验原理 1. 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具.影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。 限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性，这对细菌的功能很重要。Ⅰ和III型限制性内切酶不能在特异序列切割DNA。 故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下： (1)专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如E. coR I识别与切割序列为: 5`····GAATTC····3` 3`····CTTAAG····5` (2) 识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个； (3)识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端： (4)有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。 2. 琼脂糖凝胶电泳: 是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。 影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的染料以及电泳缓冲液的组成。 注意：EB(Ethidium Bromide溴化乙锭)是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套。 三. 实验材料与仪器 电泳仪 电泳槽 紫外透射仪 凝胶成像仪 一次性塑料手套等 质粒 标准分子量片段 核酸内切酶 酶解缓冲液(10× buffer H) 琼脂糖 5×TBE缓冲液 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 10×Loading buffer(上样液)(1% SDS,0.05%溴酚兰，50％的甘油) 四. 实验方法和步骤 1. 质粒DNA的酶解 依次加入下列溶液于1.5ml离心管中 dd H2O 7 ?l 10× buffer H 1.0 ?l DNA 1 ?l BamH1 0.5 ?l EcoR 1 0.5 ?l 轻轻混匀, 离心5 秒 ,置于37℃水浴中酶解1小时。酶解完成后，加入1.2 ?l 10×上样缓冲液(或者2 ?l 6×上样缓冲液), 混匀. 2. 琼脂糖凝胶的制备 1) 称取0.25g琼脂糖，置于三角瓶中，加入25ml 0.5×TBE或1×TAE缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。 2) 将梳子放置在制胶槽上,将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在制胶槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。 3) 室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子。 4)制好胶后将凝胶连同内槽放在含有0.5×TBE或1×TAE缓冲液的电泳槽中使用(注意:电泳槽中的缓冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致)。 3.加样 用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内。