第4讲DNA的复制机理与PCR技术2-2014总结.ppt

(一)、PCR技术的基本原理 PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA上的某个特定区段的技术。 PCR的4种基本要素： ①ssDNA模板、②ssDNA引物、③合成DNA的4种原料dNTP、④DNA聚合酶。 PCR反应的3种基本过程： ①变性、②退火、③延伸 Schematic diagram of PCR DNA片段指数扩增用下式表示： (2n – 2n) × m 式中：n为循环次数；2n是长度不定的初级和次级延伸产物；m是原始模板拷贝数。 (二)、PCR反应所需物质与扩增过程 Taq DNA聚合酶：2499bp，94kD，832氨基酸 嗜热水生菌Thermus aquatics YT-1菌株。 活性： 温度 半衰期 温度 合成速率： 92.5 ℃ 130分钟 72-80 ℃ 150-300 个/s 95 ℃ 40分钟 70 ℃ 约60个/s 97.5 ℃ 5-6分钟 55 ℃ 约22个/s 37 ℃ 约1.5个/s 22 ℃ 约0.25个/s Taq 酶的活性特点： ① 5′→3′方向的聚合酶活性， ② 5′→3′方向的外切酶活性， ③ 逆转录酶活性， ④ 较弱的非模板依赖性， ⑤ 缺乏 3 ′→ 5 ′方向的外切酶活性。 (2) 保真性： 缺乏3′→5′方向的校读(proof reading)功能 影响因素：Mg 2+、pH值、模板DNA是否损伤、dNTP浓度和4种dNTP的平衡。 提高保真性的可能途径： ① 掺入少量的具有3′→5′方向校对功能的其他耐高温聚合酶，错配率可降为原来的1/10；② 使4种dNTP的浓度相等，并尽可能保持在不影响DNA合成的最低浓度上；③ 在不影响DNA合成情况下，Mg 2+浓度尽可能低，不能大大超过4种dNTP浓度总和；④ 减少高温时间，以减少DNA热损伤；⑤ 减少循环数；⑥ 反应体系pH值在70℃时尽量低于6.0。 2. 其他耐热DNA聚合酶： Tth DNA聚合酶： 从嗜热真菌Thermus Thermophilus HB8中分离而来；在高温和MnCl2条件下，能有效的逆转录RNA，合成cDNA。 (2) Vent DNA 聚合酶： 又称Tli DNA聚合酶，从Thermococcus litoralis菌体分离而来，热稳定性极好，97.5 ℃时半衰期为130分钟；同时具有3′→5′方向的校对功能，扩增忠实性比Taq酶高5-10倍。 (3) Pfu DNA聚合酶： 从PyrococcusFurisus菌株中纯化而来，热稳定性极好，97.5 ℃时半衰期大于3小时；同时也具有3′→5′方向的校对功能，扩增忠实性比Taq酶高约12倍，最适延伸温度72-78 ℃。但是在无dNTP时它会降解模板DNA。 3. PCR引物： 引物设计原则： ① 引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性。 ②引物长度以15－30bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。 ③引物的碱基尽可能随机发布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40％－60％之间。 ④ 两个引物间不应有互补性，避免形成二聚体。引物自身也不应存在互补序列，避免自身折叠形成发夹结构或本身复性。 ⑤ 引物3′是延伸的开始，因而不能进行任何修饰，不能形成二聚体，以免浪费引物。 ⑥ 引物3′端要求是非简并性密码子，密码子的第三个碱基不应具有摇摆性。 ⑦ 引物5′限定了PCR产物的长度，但对扩增特异性影响并不大；当在5′最多添加10个碱基时对扩增并无严重的影响；因而可根据不同的试验目的对5′进行不同的修饰。以便于PCR产物的分析克隆。 (2) 引物的合成与纯化： 用户提供碱基序列→生物公司合成 合成的引物→经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或高效液相色谱分析(HPLC)加以纯化。 引物应该贮存在-20－-70℃。 (3) 引物的用量与计算： ①用量：一般是50 μl体系为10-50 pmol。 ②计算：Oligo DNA以OD260单位来计量。1 O