天津科技大学海洋生物综合实验讲义要点.doc

2012级海洋生物综合实验 实 验 指 导 书 隋丽英 袁春营 邓元告 刘洪艳 张波 编 写 海洋科学与工程学院 海洋科学系 2013年10月 第一部分 浮游动植物培养 实验一 单细胞藻类的培养 一、实验目的 1、了解单细胞藻类培养基的主要成分及培养基的制备 2、掌握单细胞藻摇瓶培养技术 二、实验内容 单细胞藻类培养基的配制；单细胞藻类的摇瓶培养技术。 三、实验原理和方法 藻类是无胚的放氧光合生物，本实验介绍的细胞培养方法，主要基于藻类细胞进行放氧光合作用这种主要功能。藻类与微生物培养有相似之处，在固相平板上分离、纯化和保种，在液相中采用通气和振荡方法促进繁殖。 四、实验条件 1、实验仪器：分光光度仪、灭菌锅、光照培养箱或光照摇床、电子天平、显微镜等。 2、实验材料：杜氏盐藻（Dunaliella salina） 3、药品和试剂： Walne培养基：以0.1%比例加入海水培养基中，配方如下。 成分 质量 溶液A： FeCl3 MnCl2·4H2O H3BO3 EDTANa2 NaH2PO4·2H2O NaNO3 溶液B 0.8g 0.4g 33.6g 45.0g 20.0g 100.0g 1.0mL 溶于蒸馏水，加热溶解，定容至1000mL 溶液B： ZnCl2 CoCl2·6H2O (NH4)6Mo7O24·4H2O CuSO4·5H2O 浓HCl 2.1g 2.0g 0.9g 2.0g 10mL 加热溶解，蒸馏水定容至100mL。 250ml锥形瓶ml量筒，1ml 移液器或刻度吸管，200ul移液器。 五、实验步骤 1、将已培养好的对数生长期的盐藻藻种接入装有100mL Walne培养基的250ml锥形瓶中，接种量约为5%。 2、将已接种的锥形瓶置于光照培养箱中静置培养（每隔一段时间摇晃一次），光照强度为60 μmol photons/m2.s，温度23-25℃。 3、藻细胞生长的测定：每隔一天测一次吸光值 OD674或进行细胞计数， 测一周左右（约2-4天进入对数期）。 4、绘制生长曲线。 实验二 轮虫的孵化、培养及生长繁殖测定 一、实验目的 了解浮游动物轮虫的孵化、培养和生长繁殖的测定方法。 实验内容 轮虫休眠卵的孵化和孵化率测定 用单胞藻培养轮虫 轮虫生长和挂卵量的测定 实验原理和方法 四、实验条件 1、实验仪器：250mL锥形孵化管、恒温水浴槽、电加热棒、充氧泵和气管、解剖镜 2、实验材料：轮虫休眠卵、小球藻培养液、天然海水、卢戈氏固定液等 五、实验步骤  第二部分 藻类DNA的提取和PCR扩增 实验三 单细胞藻总DNA的提取 一、实验目的 学习提取藻类总DNA提取的方法。 二、实验内容 藻类总DNA的提取。 三、实验原理和方法 随着植物基因工程的迅速发展，人们经常需要提取总DNA进行基因工程操作（如PCR扩增）。本实验介绍一种简便提取单胞藻总DNA的方法：先加裂解液和溶菌酶、用SDS进行细胞破碎，再经苯酚－氯仿－异戊醇抽提去除蛋白，即可得到藻类总DNA。 四、实验条件 1、实验仪器：恒温水浴锅，离心机，离心管，微量移液器等。 2、实验材料：鱼腥藻7120。 3、药品和试剂： （1）细胞裂解液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L EDTA (pH 8.0)，50 mmol/L NaCl，5%甘油。 （2）STE的配制：Tris-HCl (pH8.0) 10 mmol/L，EDTA (pH8.0) 1 mmol/L，NaCl 0.1 mmol/L （3）苯酚－氯仿－异戊醇（25：24：1） （4）TE（10mmol/L Tris-HCl pH7.4，1mmol/L EDTA） （5）无水乙醇 mL离心mL离心管合并离心，1 mL移液器，1.5 mL离心管3个。 五、实验步骤 1、收集对数期鱼腥藻7120培养物4mL，离心，用STE溶液洗涤。 2、0.5mL裂解液加入10mg/mL的溶菌酶，振荡混合完全，于37℃水浴1h。 3、加入1%SDS（10微升），蛋白酶K至100 (g/mL，于50℃水浴至少2h。 4、用等体积酚：氯仿、氯仿轻轻颠倒混匀，抽提次。 5、加入预冷的2倍体积冰乙醇，轻轻混匀直到沉淀DNA。 6、离心收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，室温下干燥，用TE重悬。 7、保存至-20℃冰箱。 六、注意事项 提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。 实验四 PCR扩增藻类16s rRNA基因片段 一、实验目的 学习PCR反应的基本原理与实验技术。 二、实验内容 用实验三提取的总DNA作模板，PCR