水稻基因OsRad21-4的表观遗传学要点.pptVIP

水稻减数分裂相关基因OsRad21-4的表观遗传学、基因克隆及蛋白表达研究 专 业： 生物化学与分子生物学 学 生： 劳龙宝 导 师： 蔡得田 教授 主要内容 研究背景 同源多倍体水稻由于减数分裂过程中染色体分配不均衡，易于形成多价体和落后染色体，以至于育性低，表现为结实率低，抵消了其形态优势，导致产量较低。 本实验室在”利用远缘杂交和多倍体化双重优势选育超级稻的战略”的指导下，选育出2个具有减数分裂稳定性（polyploid meiosis stable,PMeS）特征的多倍体水稻品系，它们本身具有高结实率，其他多倍体水稻与其杂交的后代结实率也普遍提高。 而导致PMeS品系减数分裂行为类似于二倍体的原因尚不清楚，因此，研究其分子机制成为当务之急。 目的及意义 以前对多倍体减数分裂行为的研究主要是通过细胞学手段来进行观察研究。 本文以一组高结实率水稻品系HN2026-2X、HN2026-4X及一组低结实率水稻品系9311-2X、9311-4X为主要研究对象，运用表观遗传学方法来分析多倍体水稻减数分裂相关基因OsRad21-4，进而探讨多倍体水稻结实率高低的内在机制，为今后多倍体水稻的遗传育种提供理论基础。 实验技术路线 水稻减数分裂时期的叶片 基因组DNA 亚硫酸氢钠修饰 甲基化特异性PCR 水稻减数分裂时期的叶片 基因组DNA 亚硫酸氢钠修饰 甲基化特异性PCR 实验技术路线 （二）半定量RT-PCR (三) OsRad21-4基因核心片段的克隆与表达 实验技术路线 水稻减数分裂时期幼穗 RNA 半定量RT-PCR 目的基因的核心片段 重组载体 工程菌 目的蛋白 抗体 Westernblot 方法与结果 （一）表观遗传学—DNA甲基化 水稻件数分裂时期叶片基因组DNA的提取 方法与结果 总DNA浓度(ug/ul)= OD260×稀释倍数× 50/1000 纯DNA：OD260/OD280大约为1.8（大于1.9表明有RNA污染；小于1.6表明有蛋白质、酚等污染） 方法与结果 方法与结果 水稻减数分裂时期叶片基因组甲基化特异性PCR电泳图 图2 MSP-PCR扩增的凝胶电泳图鉴定。图中M表示Marker，1、3、5、7、9、11、13泳道是以OsRad21-4-UF和OsRad21-4-UR为引物扩增的结果；2、4、6、8、10、12、14泳道是以OsRad21-4-MF和OsRad21-4-MR为引物扩增的结果，1~14泳道代表HN2026-2X、HN2026-4X、9311-2X、9311-4X、ST-05、ST-06、日本晴-2X。 方法与结果 水稻减数分裂时期幼穗RNA电泳图 图3 水稻减数分裂时期幼穗RNA琼脂糖凝胶电泳图。提取的RNA可以明显分成三条带。图中泳道1~7分别代表HN2026-2X、HN2026-4X、9311-2X、9311-4X、ST-05、ST-06、日本晴-2X （二）半定量RT-PCR 方法与结果 水稻β-Actin PCR电泳图 图4 中泳道1~8分别代表DL2000Marker、HN2026-2X、HN2026-4X、9311-2X、9311-4X、ST-05、ST-06、日本晴-2X 方法与结果 OsRad21-4基因在其中水稻材料中的表达量电泳图 图5 M表示Marker,1~2表示日本晴-2X、3~4表示ST05、5~6表示ST06、7~8表示9311-2X、9~10表示9311-4X、11~12表示HN2026-2X、13~14表示HN2026-4X 方法与结果 OsRad21-4 cDS片段及其核心片段的序列 C:\Users\lao\Desktop\OsRad21-4基因cDS序列.doc (三) OsRad21-4基因核心片段的克隆与表达 方法与结果 OsRad21-4 cDS核心片段的序列理化特征 方法与结果 OsRad21-4 cDS核心片段疏水性分析 方法与结果 OsRad21-4 cDS基因核心片段的克隆 方法与结果 OsRad21-4基因的连接与转化 水稻减数分裂时期幼穗 RT-PCR 目的基因 pGEX-6p-1 酶切、连接 重组载体 转化 重组克隆菌 碱裂解法 质粒 PCR验证及测序 转化 重组表达菌 方法与结果 1泳道表示pGEX-6p-1质粒，2~11表示重组子质粒 M表示Marker，泳道5，8，10重组质粒PCR结果 左图 表示pGEX-6p-1及其重组子质粒凝胶电泳图 右图 pGEX-6p-1重组质粒PCR验证（750bp） 方法与结果 目的蛋白诱导表达及纯化 重组表达菌 诱导条件优化 IPTG/时间/温度 摇瓶培养 菌体上清/沉淀 破菌 离心 目的蛋白 纯化 方