FACSCanto流式细胞仪原理（慕）.pptVIP

FACSCanto II流式细胞仪原理 慕静静Jingjing_mu@ BD公司介绍 BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州 BD公司介绍 位居财富周刊500强的大型跨国公司 产品涵盖诸多医疗领域 生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材 BD公司流式细胞仪产品 BD公司流式细胞仪产品 FACS Vantage SE-大型分选机 什么是流式细胞仪？ 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器 流式细胞仪的研究对象 细胞表面抗原 胞内抗原 核内抗原 核酸 分泌蛋白 流式细胞仪的检测对象 流式细胞仪工作原理示意图 流式细胞仪可提供的信息 物理信息：通过散射光信号反映 荧光信息：通过荧光信号反映 散射光信号的产生 散射光信号的意义 前向角散射光信号（FSC）：表示细胞或颗粒大小的不同。 侧向角散射光信号（SSC）：表示细胞或颗粒内部的复杂程度或颗粒性的不同 利用散射光信号对混合细胞分群 红细胞裂解的全血 荧光信号的产生 荧光信号的意义 发射光的荧光强度与结合的位点成正比 例如：荧光信号强度 荧光染料 抗体 抗原 荧光信号的表示方法 双参数点图 FACSCantoII结构组成 液流系统 将细胞引导至检测点 信号检测系统 光学系统：产生并收集光学信号 检测器：将光信号转变成电信号 电子系统 将电信号数字化，输入计算机并分析 液流系统 流动室 鞘液 酸碱平衡的电解液 样本流 单细胞悬液，浓度5?105?1 ?106/mL 液流系统-样本流速的选择 样本流速的选择 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。 （注：根据制备样本浓度随时调整流速） 信号检测系统 光学信号的产生： 激光（488nm，633nm） 光学信号的收集： 光学滤片 光电倍增管（PMT）：将光信号转换成电信号 FACSCantoII的光学滤片 长通滤片 （Longpass，LP） FACSCantoII信号检测组件 八角形检测组件 八角形检测组件检测到的光波范围 荧光染料的选择 荧光染料的激发波长 荧光染料的发射波长 荧光信号的强弱 常见荧光染料的发射波长 常见荧光染料的发射波长 异硫氰酸荧光素（ Fluorescein Isothiocyanate，FITC ）：488/525 藻红素（ Phycoerythrin，PE ）：488/575 多甲藻黄素-叶绿素蛋白（ Peridinin-Chlorophyll Protein，PerCP ）：488/670 异藻蓝蛋白（ Allophycocyanin，APC ）：633/660 碘化丙锭（ Propidium Iodide PI ）：488/620 一个完整流式实验的组成 仪器条件 模板 原始数据 仪器条件的确定 电压 阈值 荧光补偿（多色分析） 电压 PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变。 信号放大模式 放大器两种放大方式： 线性放大（lin） 对数放大（log） 线性放大（lin） 按光强度的线性关系输出信号 线性放大（lin） FSC、SSC、细胞周期检测等 对数放大（log） 按光强度的对数关系输出信号，用于大多数荧光染色实验 FACSCantoII的PMT 有三类电脉冲信号 高度信号H 面积信号A 宽度信号W 脉冲信号类型 脉冲信号类型 阈值 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。 阈值（threshhold） 屏蔽噪音信号和碎片信号 颜色补偿 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差 补偿公式 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%。 补偿模型 补偿调整的实验过程 样本准备：阴性样本，单阳性样本 调整：第一步：阴性样本调整所有PMT 第二步：单阳性样本调整补偿 判断标准： CompBeads 用于流式细胞仪多色分析时调整荧光补偿。含两种微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白?链的微球，可与小鼠/大鼠免疫球蛋白的?链结合；及阴性对照微球，不与免疫球蛋白结合。这两种微球与鼠源性的荧光抗体混合时，显示为清晰的阳性群与阴性群（背景荧光），可据此手动调整颜色补偿。 Anti-Mouse Ig补偿微球组合，产品号：552843 Anti-Rat Ig补偿微球组合，产品号：552844 Anti-Rat/hamster