浅谈肝干细胞的有关研究要点.ppt

浅谈肝干细胞的有关研究 王凤华 动物医学院基础兽医系 1.肝脏的胚胎发生 2.肝干细胞的发生 3. 肝干细胞的分离培养方法 4.肝干细胞的检测 5.胚胎肝干细胞 6..前景及展望 * 干细胞是来源于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。根据发生学来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制培养而筛选出的。成体干细胞是存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。如果根据分化潜能，干细胞分为全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。专能干细胞是一类只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化的干细胞。肝干细胞是属于成体干细胞和专能干细胞。 学者们认为，肝干细胞为肝内胆管系统源性的多潜能分化细胞群，既可向胆管细胞分化，又可向肝细胞分化。以肝干细胞到成熟肝细胞的中间产物肝卵圆细胞（oval cell,OVC）为代表的双潜能细胞等均表现典型的干细胞特征。 自1937年Kinosita 首次提出肝脏中存在可分化为肝细胞的干细胞样细胞后，肝干细胞（hepatic stem cell）的存在就一直处于人们的关注和争论中。近年来，由于对啮齿类动物及人类肝病发病机制研究的进展，肯定了肝干细胞的存在。 有关肝干细胞的主要研究进展有:通过体内、外实验证实了肝干细胞的存在;已公认肝干细胞为卵圆细胞,但肝细胞本身也具有肝干细胞功能;卵圆细胞为多向性肝干细胞;肝外细胞如胰腺上皮细胞及骨髓细胞在体内适当条件下也可向肝细胞转化;肝干细胞的活化与否及其多向性演变的发展受多种因素的调控,促进肝再生各种因素促进肝干细胞增生与演变。 1.肝脏的胚胎发生 胚胎发生过程中，肝脏的原胚有内胚层和中胚层构成，内胚层的腹侧原肠部发育成肝母细胞，进一步分化为肝细胞。肝窦内皮细胞和结缔组织来源于被肝细胞索所分隔的间叶组织，原始肝母细胞包绕门脉间充质，形成双层肝细胞圆柱体，即“胆基板”，它在胆基板重构过程中迁移入门脉间充质，形成肝内胆管，该类细胞在迁移进入门脉间充质的过程中，合成肝细胞特异性蛋白，即甲胎蛋白和清蛋白，并开始表达胆管特异性蛋白即谷氨酰转肽酶。 2.肝干细胞的发生 肝干细胞来源于前肠内胚层,在胚胎发育过程中以肝细胞形式存在,在成年哺乳动物肝脏中以小卵圆型细胞存在,表现为卵圆型小细胞、核大而胞质少并具有特殊细胞标志,因此又称肝卵圆细胞(hep-aticovalcell,HOC),就其分化能力而言属于第二级即前体细胞(progenitercell),在一定病生理条件下如毒感染或化学药物等造成肝细胞丧失或坏死损伤时肝细胞从 G0期进入细胞周期增殖，启动肝再生。 如果肝脏受损严重以致于肝细胞大部分坏死或由于某些原因阻止或延迟残余肝细胞再生时,肝干细胞被激活，可向肝细胞和胆管上皮细胞、胰腺外分泌上皮及免疫细胞等有限的几种组织细胞分化,具有多向分化增殖潜力，与骨髓干细胞同样具有多向分化的潜能，这一观点已被普遍认可。 肝干细胞来源大致上分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞。前者有的分为胆管源性卵圆细胞和分化肝细胞，有的则分为成年动物肝干细胞、胚胎肝干细胞。后者包括骨髓/造血干细胞(bonemarrowhaemat-opoeiticstemcell)、胰腺上皮细胞(prancreaticcell)、胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES)。 肝干细胞的分离培养是进行体外研究重要部分，同时也为临床应用肝干细胞治疗奠定基础。目前对于肝干细胞的分离，多采用荧光激活细胞筛选法（Fluorenscence-activated cell sorting,FACS）利用流式技术结合免疫荧光标记单克隆技术来分离，此方法分离效率和细胞 纯度显著提高，但需要特异性较高的细胞膜表面标志。现已知肝干细胞表面表达C-kit、CD34、Thy-1、Flt-3、c-met等，但这都不是肝干细胞特异性标志物。 3. 肝干细胞的分离培养方法 Suzuk et al采用FACS方法，从这13.5d胚龄的小鼠胎肝分离出c-kit-CD45f+CD45-TER119-细胞，体外培养和体内移植实验证实其具有肝干细胞特征。Monga et al运用微切割技术从胎龄9.5d的胚肝中分离肝干细胞，培养液中含有肝细胞生长因子（HGF）\Flt-3因子、干细胞（SCF）因子,可获得