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载体（vector） 质粒 噬菌体 粘粒 YAC 真核生物载体 复习题 1.λ噬菌体为什么能够作为载体？ 2.粘粒有哪些特殊的性质？ 3.YAC必须具备哪些元件？ 4.什么是穿梭质粒？ 5.将DNA导入真核细胞的方法有哪些？ * pUC18 3kb lacZ/ ori ampr 质 粒 克隆载体 双抗基因 twin antibiotic resistance 插入失活 insertionally inactivated /影印 replica plating lacZ/筛选 blue-white screening MCS 多克隆位点 MCS： multiple cloning sites ori ampr T7 promoter RBS （ribosome binding site） Star codon MCS Transcription terminater T7 expression vector 质 粒 转录载体 transcriptional vectors 探针制备：启动子（lac、T7、SP6）、in vitro（RNApol） 表达载体 expression vectors 阅读框：融合蛋白 fusion protein、启动子（lac UV-5, ? pL, T7 ） 噬菌体 5’-CG + 3’-GCCCCGCCGCTGGA GGGCGGCGACCTCG-3’ + GC-5’ 5’-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’ 左臂 右臂 非必须序列 ? 噬菌体 溶源性 lysogenic phase 烈性 lytic phase 48.5kb / 37-52kb / 20kb cos sites （cohesive sites、12bp） ? 载体（replacement vectors） EMBL3、? DASH 噬菌体 OH HO 20kb 包装和感染（裂解菌） packaging extract packaging deficient 表达用 ? 载体（溶源菌） BL21 （DE3 ） M13 噬菌体载体 M13 RF（replicative form） ssDNA Insert DNA 粘 粒 粘粒具有质粒和噬菌体的双重性质： 1. 进入受体细胞的粘粒不能裂解细胞，环化后可象质粒一样在细胞中继代。 2. 重组时，和噬菌体载体一样处理，直至用噬菌体蛋白体外包装完毕。 3. 粘粒没有cos以外的噬菌体基因，所以可以容纳更多的目的DNA，以及其他选择或标记基因。 粘 粒 ori ampr Cosmid vector ~5kb cos BamHI ori ampr Cosmid vector 37~52kb cos BamHI BamHI insert cos cos insert 粘 粒 ori ampr Cosmid vector 37~52kb cos BamHI BamHI insert cos cos insert ori ampr Cosmid vector ~5kb cos BamHI Sma I cos BamHI Sma I BamHI Sma I YACs SnaB I TEL TRP1 pYAC3 11.4kb SUP4 URA3 TEL ARS CEN4 insert TEL- telomeric DNA CEN4- centromere sequence ARS- 酵母复制起点 TRP1- 与 trp mutant 互补 URA3- 选择基因 SUP4- red-white color test 真核生物载体 2? origin YEp vector Gene X Mutant LEU2 LEU2 Yeast genome ori ampr Integrate vector LEU2 Mutant LEU2 or YEps — 酵母附加体质粒 shuttle vector— 穿梭质粒 DNA导入方法： transfection 脂质体 calcium phosphate electroporation microinjection 真核生物载体 植物组织损伤 （酚类化合物） VirA VirG VirB、C、D、E p p promoters Plant genome Vir A Vir B Vir C Vir D Vir E T-region（~23kb） Ti- plasmid ~200kb ~40kb P