BD流式细胞仪全面介绍.pptVIP

流式细胞术简介 王苗苗 流式细胞术 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量 流式细胞仪的工作原理 待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。 流动室充满鞘液，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。 流式细胞仪的工作原理 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。 流式细胞仪可检测到的细胞参数 前向角散射光 ——FSC 侧向角散射光——SSC 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据 荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。 有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳） 高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱） 一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出6个FL。 荧光检测器 光电倍增管（PMT），用来检测从细胞发出的不同颜色的荧光信号 双色反光镜，通过反射一定范围的光，透过其余光来实现分离作用 滤光片，能透过一定波长的光，但是没有反射功能，放着角度是与光束成90度。 FACSCalibur光路图 FCM测量数据的显示与分析 几个概念： %Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。 脉冲宽度（pulse width）表示细胞的粘连情况 脉冲面积（pulse area）主要用于DNA的含量测定 FL1、…..、FL13等表示细胞在各检测波长的荧光信号 数据显示: 直方图、二维点图、等高线图、密度图、 三维图等, 最常用的为散点图和直方图。 单参数直方图 每一个细胞单参数的测量数据可整理成分布统计，以分布直方图(distribution histogram)来显示。 在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。 双参数数据的显示 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图(dot plot)、等高线图(contour plot)、二维密度图(density plot)。 在二维图中，x坐标为某细胞一个参数的数值，而Y坐标为该细胞另一参数的数值。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。 外周全血细胞散射光双参数点图 等高图和密度图分析 三维图分析 流式细胞仪的细胞学应用 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡 流式细胞仪的临床应用 Flow cytometry of apoptotic cell death 细胞散射光 在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化 Flow cytometry of apoptotic cell death 荧光吸收 细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞 Flow cytometry of apoptotic cell death 细胞DNA含量 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。 DNA细胞周期分析 Flow cytometry of apoptotic cell death 线粒体功能的变化 使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rho123, DiOC6, JC-1等，可作为流式检测的探针。 Flow cytometry of apoptotic cell death