蛋白质的不稳定性及其对策研讨.pptVIP

蛋白质的不稳定性 1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、与溶质及表面间的反应 蛋白质分子与小分子物质稳定性比较 蛋白质药品中添加剂的作用 1.抗微生物保藏剂 2.可溶性增强剂 3.冻干产品填充剂 4.等渗溶液添加剂 蛋白质中常见的稳定性与相容性问题及解决方法 化学稳定性 1.PH、水解和缓冲液 2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法 3.其它化学不稳定性及制剂方法 1.PH、水解和缓冲液 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导致低物理稳定性。 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应 1.水解和脱氨反应 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺 影响因素：极端PH、温度和离子强度 最明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨速率高于水解速率 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸）残基处的裂解或环化。 缓冲液 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变影响着蛋白质可溶性和稳定性。 注意的问题： 1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓冲系统的缓冲能力，离子强度。 2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离子强度。 3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。 4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。 2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、金属离子及各种自由基激活剂。 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作用和与重金属发生配位作用。 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。 蛋白质制剂中的抗氧化剂和螯合剂 制剂中使用抗氧化剂常出现的问题 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ），磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧化 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度依赖性，多数发生在PH6-7 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸氢盐加速胰岛素破坏 防止氧化降解的措施 1.低温下制备与储藏 2.使用螯合剂消除金属催化反应 3.提高离子强度，减少二硫键的形成 4.消除过氧化物和金属污染物 5.避光 6.注意光反应和磷酸盐缓冲液条件下可能形成游离基的反应 7.生产过程中用氮或氩代替氧 8.当需维持所需蛋白质的可溶性和抗水解稳定性时，尽可能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，使用螯合剂 其它蛋白质化学不稳定性及制剂方法 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下显著加速； 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸 对策：降低PH 2.二硫键断裂 原因：温度过高 对策：降低温度 3.巯基与二硫键 在蛋白质的三级结构中，二者起主导作用，当二硫键交换并导致三维结构发生变化时，生物活性可能丧失 原因：亲核、亲电试剂导致的可逆破坏； 高温、极端的PH 二硫键的交换 * 易支持微生物生长 温度效应是连续的 温度效应是间断的（变性） 溶液中为单一相和连续相 分散（胶体）水相 没有高级结构 有二级、三级、四级高级结构 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 很少离子化位点 大量离子化位点 很少反应位点 大量潜在的反应位点 小分子 蛋白质 表面活性剂、白蛋白、预饱和 表面吸附 控制PH、表面活性剂、减低机械压力 凝集、沉淀 防冻剂/防失水剂 冷冻干燥过程中的变性 硫醇的消除（如半胱氨酸） 二硫键交换 控制PH、缓冲液 外消旋作用 控制PH、低浓度 转肽作用 低PH、螯合剂 Β-消除反应 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加工与包装过程 氧化（如甲硫氨酸氧化） 控制PH、缓冲液、低离子强度 水解、脱氨（如天冬酰胺） 可能的解决方案 稳定性问题 0.02-1 柠檬酸/柠檬酸盐 0.05-0.1 乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 螯合剂（所有水溶液） 0.1-0.5 半胱氨酸盐酸盐 0.05-0.2 巯基乙酸 0.1-0.5 硫甘油 0.1-0.5 亚硫酸盐（亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠） 0.1-1.0 抗坏血酸（异抗坏血酸、抗坏血酸钠） 抗氧化剂（所以水溶液） 制剂中的使用浓度/% 试剂 *