中国药科大学《生物药工艺学》ppt上复习题整理3.docxVIP

第十五章 生物制品 试叙述基因工程药物的一般制备过程。 获得目的基因--DNA的体外重组（切与连）；载体的选择受体细胞的选择--重组DNA分子转化（转）--转化子的筛选与鉴定（选）--外源基因的大规模表达和分离纯化--产品的检验和制剂制备 掌握单抗的制备过程：瘤细胞NS-1可培养生长；B细胞可分泌抗体----细胞融合（PEG）初步筛选（HAT）专一性筛选（ELISA）----单株化杂交瘤细胞----抗体生产 简述病毒类疫苗的一般制备方法：1.毒种的选择和减毒; 要求：有抗原性；有典型形态和感染特定组织的特性；易培养繁殖；不产生其他毒素；稳定，无恢复致病力现象；未被污染 2.病毒的培养和繁殖3.疫苗的灭活(有的用甲醛，有的用酚溶液) 4.疫苗的纯化5.冻干 病毒类疫苗制备过程中，病毒的扩增方法有哪些？ 动物培养 (Animals) 、鸡胚培养 （Embryonated eggs）, 组织培养 （Organ and tissue culture）、细胞培养 生物制品可分为哪些类别，请举例说明之。 疫苗(Vaccine): 蛋白质、多糖、核酸活载体，感染因子 抗毒素及免疫血清: 破伤风抗毒素、抗狂犬病血清 血液制品(Blood Products): 如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子(天然或重组的)、红细胞浓缩物 细胞因子(Cytokines)及重组ＤＮＡ产品: 干扰素(ＩＦＮ)、白细胞介素(ＩＬ)、集落刺激因子(ＣＳＦ)、红细胞生成素(ＥＰＯ) 诊断制品: 免疫诊断试剂盒 其它制品: 如治疗用Ａ型肉毒素制剂、微生态制剂和卡介菌多糖、核酸制剂 基因工程技术中，目的基因的获得有哪些方法？ 1、鸟枪法（基因文库）基因组DNA提取→ 限制性内切酶部分水解→与载体连接→转化、扩增与筛选 2、逆转录法（cDNA文库）mRNA纯化→cDNA第一合成→第二链合成→ cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→ cDNA文库鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴定 3、合成法；在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA 4、PCR法 ；典型PCR反应包括①模板变性 94℃以上（1～2′）②退火 50～55℃（1～2′）③延伸 72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸 熟悉几种生物技术药物的制备过程，例如胰岛素、促红细胞生成素。 胰岛素： 促红细胞生产素：根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸---筛选出EPO基因—与真核载体连接转化—重组质粒—转染CHO（筛选）--高表达CHO工程细胞—建立种子库—CHO工程细胞培养—培养液—去除杂蛋白80℃盐酸胍—初体液—凝胶层析—EPO纯度达90%--HPLC或亲和层析—EPO纯度达99% 基因治疗中常用的病毒类载体有哪些，分别有什么样的优缺点？ 逆转录病毒载体： 腺病毒：1.基因重排低 外源基因于病毒DNA重组后能稳定复制几个周期2.安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤3.宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格4.使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达 腺相关病毒：1、反向末端重复序列中没有转录调控元件，减少激活原癌基因的可能性 2、宿主广，只能形成慢性感染3、可发生位点特异性整合，有利于表达4、热稳定性好，而作为辅助病毒的腺病毒在60℃即被灭活5、安全性较好，本身不致病 单纯胞疹病毒：1、序列清楚 2、可容纳至少30kb外源基因3、宿主广，可侵染脊椎动物各种细胞4、重组病毒培养过程中易得到较高滴度5、从外周进入神经系统，不影响神经元功能但表达产物对多种类型宿主有毒性，且可引起严重免疫反应，要进入临床仍需改进 病毒载体 生物学特性 适用范围 反转录病毒载体 可感染分裂细胞； 整合到染色体中 表达时间长 有致癌的危险 Ex vivo基因治疗 肿瘤基因治疗 腺病毒载体 可感染分裂和非分裂细胞 不整合到染色体中 外源基因表达水平高 表达时间较短 免疫原性强 In vivo基因治疗 肿瘤基因治疗 疫苗 AAV病毒载体 可感染分裂和非分裂细胞 整合到染色体中 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因 在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达水平较高 In vivo 基因治疗 Ex vivo基因治疗 遗传疾病的治疗 获得性慢性疾病的基因治疗 HSV病毒载体 具嗜神经性，可逆轴突传递 可潜伏感染，容量大 可感染分裂和非分裂细胞 神经系统疾病的基因治疗 肿瘤的基因治疗 基因治疗中常用的非病毒类载体有哪些，有什么应用？ 阳离子多聚物 ，脂质体 ，多肽载