第二章生物制品的制备技巧.ppt

(3) 起始密码子和终止密码子的选择 ①如果标签蛋白在多克隆位点的前面，载体含有ATG，克隆基因最好从基因的ATG开始（前面5’非编码区的基因会翻译，如果从前面设计引物），这时基因的ATG不能作为起始密码子，只能是翻译成M，因为只有第一个ATG才能作为起始密码子，即标签前面的那个密码子。所以可以从ATG开始设计引物，加上保护碱基，不用加cozak序列。 但是下游引物必须要加上终止密码子。 ②如果标签蛋白在多克隆位点的后面，要看载体有没有自己带起始密码子，如果没有，那么引物要加ATG和cozak序列。 但是下游引物不加终止密码子，加了标签就不表达了。 （4）Kozak序列 存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。 核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。注意这段序列并不是ribosomal binding site (RBS)核糖体结合位点，而是帽子结构 。 真核生物基因中起始密码子上下游的最佳序列为，-3位为嘌呤碱基；+4位为G，起始密码子AUG中的A处于+1位。A/GCCAUGG被称为kozak序列或扫描序列。 (5) 移码突变-补碱基 如果酶切位点不是整个3个碱基的倍数，就要根据多克隆位点上改酶切位点补足3连体，使ATG前面是三联体，不然会造成移码突变。 ECORI酶切位点 ：GAATTC BamHI酶切位点 ：GG