第七章植物基因工程1-4技巧.doc

植物基因工程 基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。 植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。目的是改变植物性状，培育高产、优质high yield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。 植物转基因研究的用途： 1）理论研究：如基因功能分析； 2）实践应用：如作物遗传改良。 基因工程的基本内容 1）目的基因的分离； 2）目的基因与载体连接； 3）重组分子转入寄主细胞并繁殖； 4）阳性克隆的筛选； 5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因； 6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。 植物基因工程的一般流程 目的基因的分离→表达载体的构建→植物遗传转化→转化体的筛选、鉴定与植株再生→转基因植物的分子检测 →转基因植物的表型鉴定 →转基因植物的遗传分析、田间试验 经遗传改良的生物, 统称： genetically modified organism (GMO)； Genetically engineered organism (GEO)。 转基因植物 (transgenic plants), 又称： genetically modified plant (GMP)； genetically modified crop (GMC)。 第一节 目的基因的分离 目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或 DNA 片段，称为~。 可能是: 1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区； 2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）； 3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。来自DNA分子中的外显子。 4）一个完整的操纵子或基因簇； 5）只含启动子或终止子等元件的 DNA 片段。 1. 分离目的基因的策略/方法： 1) 基于已知/同源序列——分子杂交/筛库与PCR； cDNA文库和基因组文库 （1）构建基因组文库或cDNA文库； 基因组文库：将生物基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体连接并导入宿主细胞，进行扩增。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，包含该生物所有的基因。 cDNA文库 (cDNA library)：以某一组织、器官或处理材料中的mRNA为模板，逆转录成双链cDNA 分子，插入载体形成重组分子，再导入宿主细胞进行扩增。这些在重组体内的cDNA的集合，即为cDNA文库，包含正在表达的基因。 （2）用已知或同源序列标记探针、筛库。 经典、较常用。 筛库——菌落原位杂交 如果所要获得的基因在其它植物上已经分离 ,序列已知 ,则可以采取以下两种方法分离研究植物上的相关基因: 一是基因序列同源克隆法。根据发表的序列设计引物 ,以基因组 DNA 或 mRNA 反转录的cDNA 为模板进行 PCR 扩增。如果得到的只是基因部分序列 ,可以将其克隆至载体 ,作为探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库获得全长基因或用 RACE得到全长基因。 二是用作探针直接筛库。若能得到其它植物已分离的相关基因 ,则可以直接用作探针筛选 cDNA 文库和基因组(gDNA)文库 ,获得研究植物里的基因. （3）用PCR技术扩增目的基因 gDNA-PCR; RT-PCR RACE-PCR； 简捷、常用 2) 基于转录本表达差异 DDRT-PCR：mRNA差异显示技术， DDRT-PCR: 根据真核生物3′ 端poly(A)尾的特点设计锚定引物, 这些引物组合扩增后约能得到大致包括某一发育阶段的全部基因 ,扩增后利用测序胶分离 ,放射自显影或银染获得结果 ,并对差异片段回收、 克隆、 测序以确定其是否为目的基因。 SSH：抑制性差减杂交，此技术是以抑制 PCR和杂交二级动力学为基础的DNA扣除杂交方法。含有目的基因的样品称为检测方,不含有目的基因的样品称为驱动方。 3) 基于人工突变体—T-DNA标签法与 转座子标签法 ；适用于模式植物 T-DNA: 根癌农杆菌Ti质粒中一段可转移DNA，插入基因引起突变。 机制： T-DNA 或转座子随机插入到基因组的某一位点 ,引起该位点基因功能改变 ,这个位点就被标记 ,再利用 T-DNA 或转座子序列探针对突变基因组文库进行筛选或设计引物扩增 ,就可以分离出标记位点的基因。 4) 基于分子标记连锁图谱—图位/定位克隆；——要求精细物理图谱等 图位克隆：从一种基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因，又叫定位克隆。 机制： 根据功能基因在基因