川芎BADHcDNA全长序列.docVIP

川芎甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及序列分析 川芎(Liqusticum churning Franch Hort.)，属伞形科(Umbelliferae)多年生草本，是四川省的著名道地药材。川芎的干燥根茎为传统入药部位，具有活血行气、祛风止痛、疏肝解郁的功能，对治疗冠心病、心脑缺血等心血管疾病有明显疗效，并且还具有保健、食用等多种用途[12]。“5.12”汶川特大地震不仅造成都江堰、汶川、彭州等川芎主产区的大片川芎种植基地被毁、农业生产设施遭到严重破坏，并且导致川芎种植区的土壤条件恶化，影响了川芎的正常生长，降低川芎产量和质量，严重制约了川芎产业的可持续发展。 甜菜碱是大多数高等植物在受到盐、干旱胁迫和其它环境因子胁迫时，在体内迅速合成并积累的小分子化合物[3]。甜菜碱作为季胺类化合物，具有渗透调节功能，能够保护质膜的完整性，有助于植物适应非生物逆境[45]。甜菜碱在植物体内由胆碱经两步反应步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(choline monooxygenaseCMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenaseBADH)。其中BADH是合成甜菜碱的关键酶。1990年，Weretilnyk等人从菠菜Spinacia oleracea）中首次克隆了BADH基因的cDNA全长[6]。随后，甜菜( Beta vulgaris) [7]、大豆(Glycine max) [8]、麻疯树(Jatropha curcas) [9]、玉米（Zea mays）[10]三角叶滨藜（Atriplex triangularis）[1]等植物BADH基因的cDNA序列也被陆续克隆出来。迄今为止, 有关川芎甜菜碱的生物合成途径及相关合成基因的研究还未见报道。本实验从川芎中出了BADH基因, 并对其序列进行了分析，为下一步川芎甜菜碱合成途径相关基因的遗传操作提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 川芎采集于川芎GAP种植基地，播，用Hoagland 营养液培养。培养6 d后对部分幼苗进行盐处理，3 d。以仅用Hoagland 营养液培养的川芎幼苗为对照。1.2 总RNA的抽提 剪取在300 mmolL NaCl 溶液中生长3 d的川芎幼嫩叶片，加液氮研磨成粉末，川芎叶片总RNA的提取使用植物总RNA提取试剂盒，具体步骤按说明书进行。电泳分析RNA质量。 1.3 cDNA的获得 以纯化的RNA为模板，以oligo(dT)18为反转录引物，采用AMV反转录酶进行反转录获得cDNA。 1.4 BADH基因的PCR扩增 根据基因使用Primer Premier 5.0引物设计软件，由上海英俊生物技术有限公司合成所有引物PCR反应体系为10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，10 μmol/L 引物各1.0 μL，5 U/μL Taq聚合酶0.2 μL，50 ng/μL DNA模板2.5 μL，加H2O至25 μL。PCR扩增进行 94℃，5 min 94℃，40 sec 53℃，40 sec 72℃，90 sec 35 1.5 PCR产物的克隆与测序 PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳，采用的胶回收试剂盒回收后，与工MD-19T载体连接，转化大肠杆菌op10感受态细胞，含100 mg/mL的LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆进一步经菌落PCR鉴定后，37 °C培养12 h，送由上海英俊生物技术有限公司测序。 1.6 核苷酸序列分析 利用NCBI()的BLAST在线分析工具进行核苷酸序列分析。蛋白质的等电点及分子量计算采用ExPASY网站的Compute pI/Mw tool (http: ///tools/pi_tool.html)进行。采用DNAMAN进行序列的系统进化树分析。采用Inter-ProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/index. html) 进行结构域和功能位点预测。 2 结果与分析 2.1 川芎BADH基因的克隆与测序 1 CAGGATTTCTCGACTGGGAAACCGAGCCAGGTTACGCAACGCCAATTATTGTGAGATAAG 61 CTCACTCATTAAGCCACCCCAGGCATTCACGATTATGTTTCCTGCATCGATTGTGTGTGC 121 GGAAATTGTGAGCTGGAAAACAATTTTCGACCCAGGAAACCAGTGCTTGACCTGTATTCA 181 GCCCAAGCTTGCGAGCCCTGCCAGGAGTAGGATTTTACGTAAAGGCCAGACCAGGGCTCC