02实验二产中性蛋白酶芽孢杆菌的诱变育种详细分析.ppt

微生物学实验技术 一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育 山东农业大学生命科学学院 微生物学系 2013.09 实验内容 一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛 四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定 五、产酶菌株生长曲线的测定 六、产酶菌株的菌种保藏 实验二 产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献 一、目的意义 1、通过菌种选育，筛选获得一株高产中性蛋白酶的突变菌株。 关键技术: 实验原理：紫外线诱变 技术路线： 二、材料方法 紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。 紫外线诱变育种的原理 紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。 经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。 诱变育种中的几个原则 指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。 2个主要环节： 诱变（随机） 选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。 筛选（定向） 设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。 （一） 出发菌株（original strain） 出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； 对诱变剂敏感 野生型菌株； 从生产中选育的自发突变菌株； 诱变获得的高产菌株 出发菌株的选择标准： 出发菌株的来源： （二） 菌悬液的制备 1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散） 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象） 2. 同步培养（生理状态一致） 3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期 4.菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制 5. 菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL （三）诱变剂的选择及处理方法 1. 诱变剂的选择（高效，简便） 物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂） UV是最常用的一种诱变剂 2. 剂量的选择 突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量, 反而会使突变率下降。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。 在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至30~70%的剂量。 UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。 最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。 常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线） 3. 诱变处理方法 单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用. （四） 中间培养（CM，培养过夜） 目的：克服表型延迟 表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯