流式细胞术绪论.ppt

流式细胞术 （ Flow Cytometry ,FCM） 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。 荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。 标本处理 免疫荧光标记 直接免疫荧光标记 间接免疫荧光标记 流式细胞术常规检测时的样品制备 （一）直接免疫荧光标记法 ?取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入) 。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。 直接荧光标记法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法?取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。 本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 最小化非特异性结合的方法 常用的荧光染料（488波长激发） 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 7AAD 488 675 区分死细胞 其中PE最强，使用于弱表达抗原 FITC最便宜，使用于强表达抗原 培养细胞 制作细胞悬液 300-400目滤网过滤 免疫荧光标记 上机 流式细胞术检测培养细胞表面抗原的样品制备方法探讨 应用EDTA、胰酶、细胞刮、联用EDTA及细胞刮制备 单用EDTA或细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量低,胰酶或联用EDTA及细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量高(F=263.63,P＜0.001).胰酶组细胞表面HLA-DR和ICAM-1的荧光强度明显降低,且以HLA-DR抗原下降比例较多(HLA-DR:F=3.77,P=0.022;CD54:F=10.33,P＜0.001).EDTA组、细胞刮组、EDTA联合细胞刮组间HLA-DR和ICAM-1的荧光强度表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:EDTA联合细胞刮法是贴壁培养细胞制备单细胞悬液的一种好方法 操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的