流式细胞仪绪论.pptVIP

中国科技大学生命科学实验中心 流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM,又名FACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量 流式细胞仪仪器结构 液流系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 荧光染料及其发射波长 FITC 525nm PE 575nm PI 630nm 自发荧光与特异荧光 抗体的选择 首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：一般不提倡用 实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正） 阳性对照：检测阴性时 实验标本的处理 单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体 流式细胞仪的样品要求 单细胞悬液 被检细胞或颗粒大小0.2－80um 样品中至少20000个细胞，浓度105-107 个/毫升 流式细胞仪的光学系统 激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm and紫外光UV。 光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成，将产生的光信号引导至检测器 流式细胞仪的光学系统 1 流式细胞仪的散射光信号 FSC:表示细胞大小 SSC：表示细胞内颗粒的复杂程度 外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后） 2，荧光信号 荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 流式细胞仪的电子系统 进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析 流式细胞仪分选系统 流式细胞 仪的应用 流式细胞仪的科研应用 细胞表型分析 胞内细胞因子的检测 染色体分类研究 细胞周期和DNA倍体分析 流式标准小球定量 分选 细胞内钙离子测量 流式细胞术的临床应用 白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验 流式细胞仪数据分析（1） 流式细胞仪数据分析（2） 流式细胞仪数据分析（3） 细胞凋亡检测技术 1 几个概念 2 技术和方法 凋亡细胞的特点 在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏 凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。 细胞坏死时，细胞肿胀， FSC增大，SSC也增大 细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining Annexin V Assay建议用于悬浮细胞 Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡 谢谢大家！ How to analyze soluble proteins in FCM? + + Antigen (cytokines) Fluorescence Detector antibody Capture beads Capture antibody Beads Multiplexed Beads Shades of a color Antibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensities Various analytes Antibody coupled PE label