十二章免疫细胞化学技术总结.ppt

一、免疫组化概念 免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。 一、样本制备 标本的处理 标本的固定与保存 标本的固定与保存 标本的固定与保存 酶消化处理 抗体稀释 （一）免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物； 用缓冲液冲洗去未结合的成分； 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法） （一）免疫染色 （二）标识物的选择 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 机体内无同一物质或类似物质 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定 （三）设立对照实验 （四）常见方法举例 ABC技术 1.石蜡切片脱蜡至水 2.3%H2O2 /甲醇阻断内源性酶5min 3.PBS洗，吹干 4.抗原修复 5.无关血清1:20室温封闭20min，降低背景着色。 6.适当稀释一抗(兔抗体)孵育保湿盒30-60min。 7.PBS洗 8.生物素化二抗孵育保湿盒30min 37度 9.PBS洗 10.适当稀释ABC复合物孵育30-60min 11.PBS洗 12.0.04%DAB+0.03%H2O2 5-10min显色，充分水洗终止反应 13.苏木素衬染,封片 注意事项 1.内源性生物素活性及其消除 生物素是一种辅酶，存在于某些组织和细胞内，在应用ABC染色时会与生物素结合而产生非特异性染色。因此，在应用ABC方法前应预先以0.01%的抗生物素，以消除内源性生物素结合活性，每次作用后用PBS洗5min，更换3次。 2.ABC复合物的配制 生物素与亲合素一定要按照试剂盒要求的比例混合。 3.ABC试剂保存温度 以4℃为佳，据报告保存可达两年之久，仍能获得满意效果，而在-20℃生物活性在短期内即被破坏。 SPA法 (葡萄球菌A蛋白免疫酶法) 1.石蜡切片脱蜡至水 2.3%H2O2 /甲醇阻断内源性酶5min 3.PBS洗，吹干 4.抗原修复 5.无关血清1:20室温封闭20min，降低背景着色。 6.适当稀释一抗(兔抗体)孵育保湿盒30-60min。 7.PBS洗 8.酶标SPA湿盒孵育30min ，37度 9.PBS洗 10.PBS洗 11.0.04%DAB+0.03%H2O2 5-10min显色，充分水洗终止反应 13.苏木素衬染，封片 第三节 免疫组化的结果判断 一、阳性标记强度特征 细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性；也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为：弱阳性，阳性细胞≤25%；中阳性，阳性细胞25%~50%；强阳性，阳性细胞50%。 二、免疫组化结果的判断原则 免疫组化具有特异性强、敏感性高及定位正确等优点，但随着免疫组化应用的普及和深入，越来越多的问题也随之出现。因此，掌握对免疫组化结果的判断原则是很重要的。 1. 结果的判断；同理，没有阴性对照，也就不能做出真正阳性结果的判断。因而，没有对照的免疫组化染色，即使做出了判断也是不可信的。 2. 抗原表达必须在特定部位 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性，如LCA在细胞膜上、Keratin在细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内，EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。 3. 阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性结果不能认为具有否定意义；阳性表达有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。 4. 免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准 当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。 三、 引起假阴性和假阳性结果的原因 1. 假阴性结果的原因主要是： （1）抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度； （2）由于组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固定之标本； （3）操作步骤不当，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高； （4）组织或细胞中抗原的含量很低，所用的方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。 2. 假阳性结果的主要原因是： （1）所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合； （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物